牛奶和奶粉中卡巴氧和喹乙醇代谢物残留量的测定液相色谱-串联质谱法

牛奶和奶粉中卡巴氧和喹乙醇代谢物残留量的测定液相色谱-串联质谱法

国家标准 GB/T22984一2008 牛奶和奶粉中卡巴氧和唾乙醇代谢物 残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Determinationoftheresiduesofmetabolitesofcarbadoxand olaquindoxinmilkandmilkpowder LC-MS-MSmethod 2008-12-31发布 2009-05-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T22984一2008 前 言 本标准的附录A,附录B为资料性附录 本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口 本标准起草单位;秦皇岛出人境检验检疫局、深圳出人境检验检 疫局 本标准主要起草人:林黎、谢丽琪、欧阳姗、梁宏、叶刚、廖菁菁、庞国芳
GB/T22984一2008 牛奶和奶粉中卡巴氧和唾乙醇代谢物 残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 范围 本标准规定了牛奶和奶粉中卡巴氧代谢物唾嘻-2-梭酸(quinoxalinc-2-carboxylicacid)和唾乙醇 代谢物3-甲基唾咻-2-梭酸(3methylquinoxaline-2-carboxylicacid)残留量的液相色谱-串联质谱测定 方法 本标准适用于牛奶和奶粉中卡巴氧代谢物呤嗯咻-2-羚酸quinoxaline-2-earboxylieacid)和唾乙醉 代谢物3-甲基吮嘿咻-2-叛酸(3-methylquinoxaline-2-carboxylieacid)残留量的测定 本标准的方法检出限;唾嗯琳-2-梭酸和3-甲基呤嗯琳-2-梭酸的方法检出限牛奶为0.54g/kg,奶粉 为4.0g/kg 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度正确度与精密度 第1部分:总则与定义 GB/T6379.1一2004,IsO5725-1:1994,IDT GB/T6379.2测量方法与结果的准确度(正确度与精密度第2部分;确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法(GB/T6379.2一2004,I1sO5725-2:1994,IDT GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682一2008,IsO3696:1987,MOD 原理 用甲酸溶液消化试样,使牛奶和奶粉中天然存在的酶失活,然后加人蛋白酶水解,盐酸酸化,离心过 滤后,固相萃取柱净化,液相色谱-串联质谱仪测定,内标法定量 试剂和材料 除另有说明外,所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水 甲醇:色谱纯 4.2甲酸;色谱纯 4.3 乙酸钠 44 乙酸乙醋 452%甲酸-乙酸乙酯溶液;向400ml乙酸乙酯中加人10mL甲酸,用乙酸乙酯定容至500mL 4.60.6%甲酸溶液;量取6.0ml.甲酸,用水溶解、定容至1L 4.70.1%甲酸溶液;量取1.0ml 甲酸,用水溶解、定容至1L 4.8甲酸-甲醉溶液(19+1);用190ml.甲酸溶液(4.2)与10ml甲醉(4.1)混合 4.90.1mol/儿盐酸溶液;量取8.3ml.浓盐酸,用水溶解、定容至1L 4.100.3mol/L盐酸溶液:量取25mL浓盐酸,用水溶解、定容至1L
GB/T22984一2008 4.11Protease蛋白酶;SigmaP5147或相当者，一18C以下保存 4. .120.01g/ml蛋白酶水溶液;称取1.00gProtease蛋白酶(4.11),用水溶解、定容至100ml,4 保存 10%乙酸溶液;量取100ml.乙酸,用水溶解、定容至1L 4.13 4.140.05mol/儿1乙酸钠溶液;称取6.8g乙酸钠用800ml.水溶解,再滴加10%乙酸溶液以调节溶液 pH=7,用水定容至1L 4.15 么酸钠-甲醉溶液(19十1);用190ml乙酸钠溶液(4.14)与10mL甲醇(4.1)混合 4.16甲醇-水溶液(1十4) 4.17Ti碱.sSgmaT1503或相当者 4 .181.0mol/ITris溶液;称取121lgTris碱(4.17),用水溶解、定容至1L,4C保存 4.19唾曙咻-2-梭酸、3-甲基唾嗯琳-2-梭酸、唾嗯琳-2-梭酸-d4标准物质纯度>99% 4.20标准储备液:l00mg/L 准确称取适量标准物质,分别用甲醇溶解定容,配成100mg/L的标准 储备液,在一18C以下保存 基质混合标淮工作溶液.根据灵敏度和使用需要,用空白样品提取液配成不同浓度(E/L)的混 4.21 合标准工作溶液,在4C保存 4.22内标工作溶液:准确称取适量唾嗯琳-2-梭酸-d4标准物质,用甲醇溶解定容,配成1004g/L的标 准工作溶液,在4C保存 4.23OasisMAx固相萃取柱'或相当者:60mg,3mL 用前分别用3mL甲醇和3ml.水活化保持 柱体湿润 4.24滤膜:0.2Am 仪器和设备 5.1液相色谱-串联质谱仪;配有电喷雾离子源 5.2固相萃取真空装置 5.3吹氮浓缩仪 5.4旋涡振荡器 . 分析天平:感量0.1mg和0.01g 6 55 真空泵 5.7低温离心机可制冷到4C,转速大于500; r/min 移液器量程:10L~ -100L和100AL1 5 8 00pl 5 聚丙烯离心管:15ml.和50ml,具塞 5 10pH计:精度士0.02pH单位 试样制备与保存 试样的制备 取不少于500g有代表性的牛奶或奶粉,充分混匀,分为两份,置于样品瓶中,密封,并作上标记 试样的保存 牛奶置于4C冰柜中避光保存,奶粉则于室温下置于干燥器保存 OasisMAX固相萃取柱是waters公司产品的商品名称,给出这一信息是为了方便本标准的使用者,并不是表 示对该产品的认可 如果其他等效产品具有相同的效果,则可使用这些等效产品
GB/T22984一2008 测定步骤 7.1提取 7.1.1牛奶 准确称取5g牛奶样品精确到0.01g),置于50ml聚丙烯离心管中,加人一定量的内标溶液 4.22)，使其浓度为2.0ng/g,再加人10ml0.6%甲酸溶液(4.6),混匀后,置于(47士3)C振荡水浴 中振摇1h;然后先加人3ml.l.0mol/1Tris溶液(4.18),再加人0.3ml蛋白酶水溶液(4.12),充分 混匀后,置于(47士3)C振荡水浴中酶解16h18h 加人20mL0.3nmol/几盐酸(4.10),振荡5min 在10C以5000r/min离心15mn,上清液过滤 7.1.2奶粉 取12.5g奶粉于烧杯中,加适量35C一50C水将其溶解,待冷却至室温后,加水至总质量为 100g，充分混匀后准确称取5g样品(精确到0.01g),置于50mL聚丙烯离心管中,按7.1.1步骤进行 处理 7.2净化 将7.1所得溶液以约1mL/min的流速全部通过OasisMAX固相萃取柱(4.23),分别用15ml乙 酸钠-甲醇溶液(4.15)淋洗固相萃取柱,真空抽干15min 再用5ml甲醇,3ml水,5mL0.1mol/儿L 盐酸(4.9)和3mL甲醇-水溶液(4.16)分别淋洗,真空抽干15min,然后用2m乙酸乙酯淋洗固相萃 取柱,弃去全部淋出液,最后用3ml甲酸-乙酸乙酯溶液(4.5)洗脱唾嗯琳-2-梭酸和3-甲基呤嗯畦-2-梭 酸,置于15ml聚丙烯离心管中,在45C用氮气浓缩仪吹干 准确加人1.0ml甲酸-甲醉溶液(4.8) 溶解残渣,过0.2Am滤膜,供液相色谱-串联质谱仪测定 空白基质溶液的制备 称取阴性样品5g(精确到0.01g),按7.1和7.2步骤操作 测定条件 液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下 色谱柱.ODs,.3Am,l00mmx2.1mm(内径)或相当者 a 流动相:甲醇、乙睛以及0.1%甲酸溶液(时间梯度见表1). b 表1流动相时间梯度 时间/min 甲醇/% 乙睛/% 0.1%甲酸/% 8C 0.o 13 40 45 10,0 15 20 0. 64 16 13 13.1 80 13 20.0 80 e)流速:0.2mL/min; d 柱温:30C; e)进样量:30L 7 .4.2质谱参考条件 质谱参考条件如下 a)离子源;电喷雾离子源; b)扫描方式:正离子扫描; 检测方式;多反应检测;
GB/T22984一2008 d)分辨率:单位质量分辨率; 电喷雾电压;5000V, fD 雾化气流速;8.0L/min; 气帘气流速:7.0L/min:; g 辅助气流速;5.0L/min h 离子源温度;450C 定性离子对,定量离子对及其他质谱参数见表2 表2各种化合物的定性离子对、定量离子对,去簇电压、碰撞电压、碰撞池出口电压 定量内标 定性 定量 去簇 聚焦 碰撞 碰撞池出口 化合物名称 离子对 离子对 离子对 电压/电压电压 电压 m/: m/) m1/ 175.0/129.2 120 12 20 23 唾嗯啾-2-段酸 175,0/131.2 179.2/133.2 21 175.0/131.2 26 120 12 189.2/143.l 26 120 23 12 3-甲基瞠嗯琳-2梭酸 189,2/145,1 179,2/133.2 189,2/145,1 26 120 21 12 7.4.3液相色谱-串联质谱测定 7.4.3.1定性测定 每种被测组分选择1个母离子,2个以上子离子,在相同实验条件下,样品中待测物质的保留时间 与混合标准工作溶液中对应的保留时间偏差在士2.5%之内,各分析化合物的参考保留时间见表3,样 品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的混合标准工作溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比 较,若偏差不超过表4规定的范围,则可判定为样品中存在对应的待测物 表3分析化合物参考保留时间 保留时间/mimnm 化合物名称 啾-2-叛酸 10.10 3-甲基畦昭眯-2-段酸 1l.11 表4定性确定时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度K K50 20GB/T22984一2008 结果计算 试样中每种化合物残留量按式(1)计算 x-x会是》会M*H 式中: 一试样中被测物残留量-单位为微克每千克(ne/ke) 基质标准工作溶液中被测物的浓度,单位为纳克每毫升(ng/ml); 试样溶液中被测物的色谱峰面积; 基质标准工作溶液中被测物的色谱峰面积; 试样溶液中内标物的浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL); 基质标准工作溶液中内标物的浓度,单位为纳克每毫升(ng/ml); 基质标准工作溶液中内标物的色谱峰面积; 试样溶液中内标物的色谱峰面积; 样液最终定容体积,单位为毫升(mL); 试样溶液所代表试样的质量,单位为克(g). 7m7 计算结果应扣除空白值 精密度 一般规定 本方法的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的,重复性和再现性的值 以95%的可信度来计算 9.2重复性 在重复性实验条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r,样品中两种分析化 合物的添加浓度范围及重复性方程见表5 表5添加浓度范围及重复性和再现性方程 单位为毫克每千克 化合物名称 样品基质添加浓度范围 重复性限r 再现性限R 牛奶 g"=0.8797lgm一1.o179gR=0.8445lgm一0.6489 0.5一5.0 唾嘻琳-2-翔酸 奶粉 g"=0.9561gm一1.0554gR=0.7578g朋一0.6163 4.040.0 R=0.72107 牛奶 0,55.0 "=0.8697lgm-1.0772 lgm一0.6492 lgr 3-甲基唾嗯啾-2-盥酸 奶粉 4.040.0 lgy=0,9821lgm-0,9851lgR=0,8600lgm一0.599" 注:m为两次测定结果的算术平均值 如果差值超过重复性限,应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定 9 再现性 在再现性实验条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R,样品中两种分析化 合物的添加浓度范围及再现性方程见表5
GB/T22984一2008 附 录A 资料性附录 标准物质提取离子流图 唾嘻啾-2-梭酸(QCA)和同位素内标(QCA-d4)标准物质提取离子流图,见图A.l;3-甲基咋飕啡-2- 梭酸(MQCA)和同位素内标(QCA-d4)标准物质提取离子流图,见图A.2 10.15 QCA-d4 a0.19 2000 OCA 6000 1500 4000 16.52 0.992.01 i0. 1000 8.75 18.22 货 215.41 3.55 .2 6.42.69 2000 500 10.53 10 12 1618 20 10 12 14 161820 min /min 10,2 10.15 0cCA-d4 O0CA 6000 6000- 4000 4000 0.992.01 41l652 8.75 0.068 18.1 四祭e互" 18.22 17.74 3.556,,42 12.72 A”a牌烈 O 200 67 2000- tiw 20 10 12 16 18 20 /imin min 图A.1隆恶曝-2-羚酸(QCA)和同位素内标(QCA-d4)标准物质提取离子流图 1l.11 10.15 3000- MQCA 0CA-d4 6000- 2000 4000- 0,992.01 10.42 ,I8.22 3.55 1000- 6,42 ", 2000 7.69 wk 小1.39 1 10 12 14 16 12 1820 14161820 t/min min 10.15 cA-l4 MQCA L00e4 II1.07 6000 4000 0.992.01l l0.4? 500000 爷,8l56.18,2 3.55 8.75 .29 16.13 2000 他e AA 3.21 w一W" e. 92 M叫 .OI8. 000 o 12 16 18 2o 1I012 i6 I820 imin min 图A.23-甲基睦恶琳-2-按酸(QCA)和同位素内标(QcA-d4)标准物质提取离子流图
GB/T22984一2008 附 录 B 资料性附录 回 收 率 本方法中唾嘻啾-2-梭酸和3-甲基呤嘻啾-2-梭酸在牛奶和奶粉中添加浓度及其平均回收率的试验 数据,见表B.1 表B.1畦恶嗽-2-羚酸和3-甲基隆恶琳-2-梭酸在牛奶和 奶粉中添加浓度及其平均回收率的试验数据 化合物名称 样品基质 添加浓度/u4g/kg 平均回收率/% 0.5 83.1 1.0 75.7 牛奶 80.5 2.0 5.0 89,9 嗯味-2-梭酸 4.o 79.1 8.0 85.6 奶粉 16.0 87.7 40.0 88.7 0.5 77.4 l.0 85.3 牛奶 2.0 72.1 5 .0 79.1 3-甲基畦瞎啾-2按酸 4.0 75.0 8.0 85.3 奶粉 16,0 88.4 40.0 77.0