饲料添加剂木聚糖酶活力的测定分光光度法

饲料添加剂木聚糖酶活力的测定分光光度法

国家标准 GB/T23874一2009 饲料添加剂木聚糖酶活力的测定 分光光度法 Determinationofxylanaseaetivityinfeedadditives Spectrophotometricmethod 2009-05-26发布 2009-10-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T23874一2009 饲料添加剂木聚糖酶活力的测定 分光光度法 范围 本标准规定了用分光光度法测定饲料添加剂中木聚糖酶的活力 本标准适用于饲料添加剂木聚糖酶产品,最低检出量为10.0U/g 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 原理 木聚糖酶能将木聚糖降解成寡糖和单糖 还原性寡糖和单糖在沸水浴条件下可以与3,5-二硝基 水杨酸(DNS)试剂发生显色反应 反应液颜色的深度与酶解产生的还原糖量成正比,而还原糖的生成 量又与反应液中木聚糖酶的活力成正比 因此,通过分光比色测定反应液颜色的强度,可以计算反应液 中木聚糖酶的活力 在37c、pH为5.50的条件下,每分钟从浓度为5mg/mL的木聚糖溶液中降解释放1Amol还原 糖所需要的酶量为一个酶活力单位U 试剂与溶液 除特殊说明外,所用的试剂均为分析纯,水均为符合GB/T6682中规定的二级水 4.1氢氧化钠溶液,浓度为200g/几 称取氢氧化钠20.0g 加水溶解,定容至100ml 4.2乙酸溶液,浓度为0.1mol/ 吸取冰乙酸0.60nmL 加水溶解,定容至100mL 4.3乙酸钠溶液,浓度为0.1mol/I 称取三水乙酸钠1.36g 加水溶解,定容至100ml 4 乙酸-乙酸钠缓冲溶液,浓度为0.1mo/L,pH为5.50 称取三水乙酸钠23.14g,加人冰乙酸1.70ml 再加水溶解,定容至2000mL 测定溶液的pH 如果pH偏离5.50,再用乙酸溶液(4.2)或乙酸钠溶液(4.3)调节至5.50. 4.5木糖溶液(C,IHno.),浓度为10.0mg/ml 称取无水木糖1.000g,加乙酸-乙酸钠缓冲溶液(4.4)溶解,定容至100m 4.6木聚糖溶液,浓度为100mg/mL 称取木聚糖(Sigmax0627)1.00g,加人0.32只氢氧化钠,再加人90ml水,磁力搅拌,同时缓慢 sigmaxo627是商品名.给出这一信息是为了方便本标准的使用者,并不表示对该产品的认可 如果其他产品 1 能有相同的效果,则可使用这些等效的产品
GB/T23874一2009 加热,直至木聚糖完全溶解 然后停止加热,继续搅拌30min,加人0.5mL冰乙酸 继续磁力搅拌,测 定其pH 如果pH为5.50,用乙酸-乙酸钠缓冲溶液(4.4)定容至100mL 如果pH偏离5.50,再用乙 酸溶液(4.2)或乙酸钠溶液(4.3)调节至5.50,然后再用乙酸-乙酸钠缓冲溶液(4.4)定容至100ml 使 用前适当摇匀 4C避光保存,有效期为12h 4.7Ds试剂 称取3.5-二雕基水杨般了.15g,加水500ml搅拌3一5水浴至45c 然后逐步加人I0ml. 氢氧化钠溶液(4.1),同时不断搅拌,直到溶液清澈透明(注意;在加人氢氧化钠过程中,裕液温度不要超 过48C) 再逐步加人四水酒石酸钾钠91.0g,苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g 继续45C水浴 加热,同时补加水300mL,不断搅拌,直到加人的物质完全溶解 停止加热,冷却至室温后,用水定容至 1000ml 用烧结玻璃过滤器过滤 取滤液,储存在棕色瓶中,避光保存 室温下存放7d后方可使 用,有效期为180 d 仪器与设备 5.1实验室用样品粉碎机或碾钵 5.2分样筛:孔径为0.25mm. 5.3分析天平;感量0.0o1 g 5.4pH计:精确至0.01 5.5磁力搅拌器;附加热功能 5 .6 电磁振荡器 5.7烧结玻璃过滤器;孔径为0.45m. 5.8离心机:最大离心加速度不小于2000 5 恒温水浴锅;温度控制范围在30C一60C之间,精度为0.1C 5. .10秒表;每小时误差不超过5s 可见分光光度计 5. 11 5. .12移液器;精度为1lAl 绘制标准曲线 吸取乙酸-乙酸钠缓冲溶液(4.4)4.0ml,加人DNNS试剂(4.7)5.0ml,沸水浴加热5min 用自 来水冷却至室温,用水定容至25.0mL,制成标准空白样 6.2分别吸取木糖溶液(4.5)1.00ml. 2.00ml3.00ml、4.00mL5.00ml,6.00mL和7.00 ml 分别用缓冲溶液(4.4)定容至100mL,配制成浓度为0.10mg/ml,0.20mg/mL、0.30mg/mL 0.40mg/mL,0.50mg/mL,0.60mg/mL和0.70mg/mL木糖标准溶液 6.3分别吸取上述浓度系列的木糖标准溶液各2.00mL做两个平行),分别加人到刻度试管中,再分 别加人2.0nml缓冲液(4.4)和5.0mlDNs试剂(4.7) 电磁振荡3s5s,沸水浴加热5min 然后 用自来水冷却到室温,再用水定容至25ml 以标准空白样为对照调零,在540nm处测定吸光度 A值 以木糖浓度为Y轴、吸光度A值为X轴,绘制标准曲线 每次新配制DNS试剂均需要重新绘制 标准曲线 反应用酶液的制备 7.1固体样品的反应用酶液制备 按照附录A中建议的称样量称取试样两份,精确至0.001g 加人40mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液
GB/T23874一2009 4.4) 磁力搅拌30min,再用缓冲溶液(4.4)定容至100mL,在4C条件下避光保存1h一2h 上离 心机(G.81004离心了mimn一5min,取上清液;再用缓冲游被(.4)做适当稀释(稀释后的待渊膊液中 木聚糖酶活力最好能控制在0.04U/ml0.10U/ml之间 7.2液体样品的反应用酶液制备 液体样品可以直接用乙酸乙酸钠缓冲溶液(4.4)进行稀释,定容(稀释后的酶液中木聚糖酶活力最 好能控制在0.04U/ml0.10U/mL之间) 如果稀释后酶液的pH偏离5.50,需要用乙酸溶液 4.2)或乙酸钠溶液(4.3)调节校正至5.50,然后再用缓冲溶液(4.4)做适当稀释定容 测定步骤 吸取10.0m木聚糖溶液(4.6),37C平衡20min 吸取10.0mL经过适当稀释的酶液(7.1或7.2),37C平衡10min 吸取2.00mL经过适当稀释的酶液(已经过37C平衡),加人到刻度试管中,再加人5mLDNS试 剂(4.7),电磁振荡3、一了s 然后加人2.0ml木聚糖溶液(4.6).37C保温30nmin.沸水浴加热 5mmn 用自来水冷却至室温,加水定容至25ml.电磁振荡3s一5、 以标准空白样(6.1)为空白对照 在540nm处测定吸光度Aw 吸取2.00mL经过适当稀释的酶液(已经过37C平衡),加人到刻度试管中,再加人2.0mL木聚 糖(4.6)(已经过37C平衡),电磁振荡3s s,37C精确保温30min 加人5.0mlDNS试剂(4.7). 5 电磁振荡3s5s以终止酶解反应 沸水浴加热5min,用自来水冷却至室温,加水定容至25mL,电 磁振荡3s一5s 以标准空白样(6.1)为空白对照,在540nm处测定吸光度AE 试样酶活力的计算 用于酶解反应的稀释酶液中木聚糖酶的活力按式(1)和式(2)计算 [Ae二An)XK十C x ×1000 M× 式中: Xp -稀释酶液中木聚糖酶的活力,U/ml 酶反应液的吸光度; AE 酶空白样的吸光度; AR 标准曲线的斜率; 标准曲线的截距; Co M 木糖的摩尔质量,M(CHO)=150.2g/mol -酶解反应时间,min; 转化因子,1nmmol=1000mol 1000 X值应在0.04U/mL一0.10U/mL之间 如果不在这个范围内,应重新选择酶液的稀释度,再 进行分析测定 X=Xp×D 式中: X -试样中木聚糖酶的活力,U/g(或U/mL); D 试样的稀释倍数
GB/T23874一2009 酶活力的计算值保留三位有效数字 10 重复性 每个试样应取两份平行样进行分析测定,相对误差不超过8.0%,二者的平均值为最终的酶活力测 定值
GB/T23874一2009 附 录A 资料性附录 样品酶活力与建议称样量的对应关系 样品酶活力与建议称样量的对应关系见表A.1 表A.1 木聚糖酶活力/(U/g)(或者U/mL 称样量/g(或者mL >2000 0.10.2 5001999 0.20,5 200499 0.51.0 50~199 1.02. 2.05 1049