基于光学椭偏成像的无标记蛋白质芯片分析方法通则

基于光学椭偏成像的无标记蛋白质芯片分析方法通则

国家标准 GB/T37908一2019 基于光学椭偏成像的无标记蛋白质芯片 分析方法通则 Generalanalysisregulationofthelabel-freeproteinmieroarraybasedon imugingelpometry 2019-10-18发布 2020-05-01实施 国家市场监督管理总局 发布 币国国家标准化管理委员会国家标准
GB/37908一2019 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由全国生物芯片标准化技术委员会(SAC/TC421)提出并归口 本标准起草单位:科学院力学研究所、贵州金玫生物技术有限公司 本标准主要起草人.靳刚牛宇、韩克兵、王磊
GB/37908一2019 基于光学椭偏成像的无标记蛋白质芯片 分析方法通则 范围 本标准规定了基于光学椭偏成像的无标记蛋白质芯片的术语和定义、原理、仪器组成与要求,技术 指标、测试方法和检测分析方法与步骤 本标准适用于基础生物学、生物医学和临床医学中分析检测单一的或混合的粑标蛋白质分子 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T279902011生物芯片基本术语 GB/T28641一2012蛋白质微阵列芯片通用技术条件 JJF1265生物计量术语及定义 术语和定义 GB/T279902011、GB/T286412012和JF1265界定的以及下列术语和定义适用于本文件 3.1 无标记蛋白质芯片labe-freeproteinmieroarray 能够直接将探针分子识别靶标分子的过程定性或定量显示,而无需借助物理、化学或生物的方法 如放射性元素标记、荧光标记等)对识别过程进行标记的蛋白质芯片 3.2 质量面密度surfaeemassdensity 单位面积的蛋白质芯片表面上生物分子的质量 3.3 芯片布局meroarraydesignm 由检测需求和待测靶标分子性质所决定的,探针分子在芯片表面上的设计和排布 3.4 表面改性surfacemodifieation 采用物理、化学,生物学方法,为实现探针分子的组装和阻隔非特异性吸附的目的,对芯片基底进行 表面处理的过程 3.5 探针组装proheimmobilization 通过物理吸附,共价结合和定向固定等方法,将探针分子装配到芯片表面上的过程 3.6 分子识别reeognitionm 利用生物分子间的特异亲和性,实现探针分子对靶标分子特异性捕获的过程
GB/T37908一2019 3.7 标准片calibrationsubstrate nmm20nmm 预先在抛光硅基片上制作并进行厚度标定的二氧化硅膜层 膜层厚度在1 范围内,成 台阶状分布 缩略语 下列缩略语适用于本文件 anti-IgG;抗免疫球蛋白抗体(Anti-ImmunoglobulinGAntibody) BSA:牛血清白蛋白(AbuminfromBovineSerum) CCD电荷耦合元件(Charge-coupledDevice) IgG:免疫球蛋白(Immunoglobulin G OperatingCharacteristie Roc:受试者工作特征(Receirver 5 原理 基于光学椭偏成像的无标记蛋白质芯片是将多元蛋白质芯片技术和高空间分辨率的光学椭偏成像 技术相结合发展而成的一种无标记、快速、高灵敏度、多通量、自动检测的蛋白质分子间相互作用分析方 法,具有如下特点 样品无需标记、直接检测" a 集成了芯片制备和检测功能,可快速进行多指标、多样本的并行检测; b》 主动输运式分子反应,速度快,样品消耗少; c 采用高空间分辨光学椭偏成像测量,非接触,无扰动、对样品无破坏、检测灵敏度高,可进行定 d 性和定量检测 结果直观,可鉴别伪信号 e 在用于蛋白质分子间相互作用检测时,首先将探针分子分别装配在芯片基底的格式化表面上各个 单元中,形成格式化的探针微阵列 当含有靶标分子的溶液输运到探针微阵列后，探针分子由于分子识 别会与靶标分子发生特异性结合,导致该反应单元上质量面密度增加 具有原子层量级厚度分辨能力 的光学椭偏成像技术对这一变化及其敏感,可以定量显示质量面密度的变化,实现粑标分子的检测,判 断靶标分子的存在与否或含量多少 o 仪器组成及要求 6.1芯片反应器 芯片反应器用于实现蛋白质芯片的表面格式化溶液输运样品分配,探针组装以及探针分子对吧 标分子的识别、清洗和吹干等过程,由此生成适用于椭偏成像技术检测的多元蛋白质芯片 芯片反应器 由微量流体泵、微量液池、微流道输运系统、微反应器阵列、清洗吹干装置和机械运动组件以及控制装置 等组成 其基本工作原理是;适时、定量、按程序在微量流体泵的推动下将各种溶液输送到微反应器的 指定的反应单元中,进行探针装配及生物分子与探针相互作用 其中,微量流体泵多采用多通道蠕动 泵流量在1AL/min50L/min范围内可控,并至少具有八个独立通道 微量液池的容积不少于 0.2mL 微流道输运系统采用聚四氟乙烯材质制作 微反应器阵列至少为独立八单元,每反应单元的 容积不多于500AL,相邻两反应单元的距离大于2mm 清洗吹干装置能够实现1lALmin一50Lmin流 速范围内液路清洗和10kPa50kPa压力范围内的气路吹干
GB/37908一2019 6.2芯片检测器 芯片检测器采用光学椭偏成像技术对蛋白质芯片进行检测,通过推算质量面密度的变化量,得到各 反应单元上靶标分子与探针分子相互作用的结果,计算出靶标分子溶液浓度等 芯片检测器通常包括 人射光源、扩束准直光路,起偏器、补偿器、样品台、检偏器,成像系统、CCD,图像采集部分和控制部分 等 其基本工作原理是;扩展的偏振光束平行地照射到芯片表面上,芯片对探测光束进行调制从而使得 反射光波中载有芯片的信息,再经检偏部分,由cCD摄取图像 最后利用图像灰度与靶标分子的质量 面密度之间的关系,获得靶标分子溶液浓度 其中,人射光源的波长多用633nm,带宽50nmm,功率稳 定性优于2% 扩束准直光路直径大于1em,照度均匀性高于95% 起偏器、补偿器和检偏器的消光 比大于1000:1(针对中心波长) 样品台被检测面与自准直仪光轴垂直度在30"范围内,工作台倾斜 调整精度小于1',工作台升降调整精度小于0.01mm CCD的信噪比高于60dB,照度高于0.2lm 6.3计算机操控系统 计算机操控系统是以计算机作为信息处理中心,对系统各部分,包括,微流道芯片反应器和芯片检 测器,进行操作和自动控制,并实现对系统数据和检测结果的采集,处理和分析 计算机操控系统包括 计算机、运动控制器、操作和控制软件以及图像采集、处理和分析软件 其基本工作原理是;根据芯片制 备和靶标分子检测的要求,在操作和控制软件的指令下,计算机通过控制器对芯片反应器和芯片检测器 中的机械运动和数据采集进行程序控制,其控制定位精度小于0.02mm,运行速度小于300mm/s,实 现适时、定量、按程序的运行效果,数据结果反馈回计算机和控制器进行处理;在图像处理和分析软件的 指令下,计算机进行图像采集、处理和数据分析,获得检测结果的数据,并打印输出 仪器的性能指标及测试方法 7.1正常工作条件 在如下条件下进行试验: 电源:交流220V士22V;50Hz士1Hz; a b)环境温度;10C30C; 相对湿度;30%一75%; c d)大气压力;86kPa106kPa 7.2检测动态范围 检测动态范围是指仪器能够检测的靶标分子浓度的有效范围 检测前,需要利用硅基底上带有 2nm、4nm和8nm厚度台阶的二氧化硅膜层标准片检查仪器的动态检测范围是否达到要求,具体测 试步骤为 将标准片置于芯片检测器平台上,分别对基底2 nm、4nm" 和8nm台阶部分进行测量,读取各 梯度样品的信号值(Y),进行分析; 调整芯片检测器中起偏器和检偏器的角度,使上述四个测量值(Y)与厚度(X,)之间均于线 b 性,利用式(1)计算的相关系数应大于95% 习(x，-).(Y- # 相关系数 V(X，-X、习Y-3 7.3最低检测限 最低检测限是指仪器能够检测出的某类待测靶标分子溶液的最低浓度值,具体测试步骤为
GB/T37908一2019 a 将anmti-lgG溶液用磷酸盐缓冲液等比例稀释为100ng/'ml.50ng/ml.10ng/ml5ng/'ml. 和1ng/mL备用 b将浓度为10AL/ml的IgG作为探针装配在芯片表面,用SA封闭 将上述5个浓度的anti lgG样品每种各取25L输运到探针单元上进行反应,每个浓度样品重复5次 将制备好的 芯片通过芯片检测器测量,读取各浓度样品的信号值,进行分析 如果灰度增加值大于三倍标准差,即认为该浓度可以被检测到,最低检测限的推荐值不低于 10 ng/ml 7.4重复性 重复性是指在相同条件下对同一样品进行多次检测所得结果之间的一致程度,包括志片内重复性 和芯片间重复性,具体测试步骤为 a 在同一芯片上采用同样方法制备了个样品单元,通过芯片检测仪对各单元读取样品信号值I 其中i=1,2,3,4,5),利用式(2)计算芯片内重复性误差; -" I 重复性误差 ×100% 习 D)在5片芯片上选取同一反应单元,采用同样方法制备5个样品单元,通过芯片检测仪对各单元 读取样品信号值I(其中i=1,2,3,4,5),利用式(2)计算芯片间重复性误差; 芯片内重复性误差应小于3%;芯片间重复性误差应小于10% 7.5准确度 准确度是指样品检测结果与真值的一致程度,利用与其他公认方法测量结果对比的方法进行测试 具体测试步骤为 在抛光硅片上制备一个饱和的lgG膜层作为样品备用; a b 通过标定过的光学椭偏仪测量Ig(G的膜层厚度a,利用芯片检测器测量膜层的厚度为d; c 利用式(3)进行计算准确度,应大于95% ld-4 (3 准确度=1一 ×100% 分析方法及步骤 8 8.1仪器的校准 一50nm的标准片对仪器进行校准,并谢试仪器各项指标是否符合 采用二氧化硅膜层厚度在1nm" 使用要求,具体参数指标如7.2~7.5所示 8.2芯片反应器清洗 每次使用前,均需清洗芯片反应器,推荐的清洗流程如下 将充足的清洗液以20L/min的速度注人微流道芯片反应器,持续5min: a b 将充足的去离子水以20AL/nmin的速度抽人微流道芯片反应器,持续5min: 重复以上过程至少两次后,抽干微流道芯片反应器残余的液体 c
GB/37908一2019 8.3芯片的制备方法 8.3.1芯片布局设计 蛋白质芯片上需同时具备空白对照单元、探针对照单元、阴性对照单元、反应单元以及阳性对照单 元等 8.3.2芯片基底 -般要求具有高反射率、具有原子层量级平整度的光学表面,如抛光硅片等 8.3.3 表面改性 表面改性的目的是组装探针分子、控制探针分子的面密度、保持探针分子活性、抑制非特异性吸附 常采用的方法包括盥基化处理、醛基化处理、疏水处理、定向固定和仿生学改性等 8.3.4探针组装 探针组装的目的是高效捕获靶标分子,从而提高检测灵敏度和控制动态检测范围 探针组装的过 程包括探针分子输运,并装配到芯片表面.请选.封闭等步骤,应选择合适的浓度,流速、反应时间等参数 及清洗和封闭的试剂条件 8.3.5靶标分子捕获 靶标分子捕获过程包括靶标分子输运到芯片表面,并与探针分子发生识别以及后续的清洗等步骤 应选择合适的浓度、流速、反应时间等参数 8.4样品的测定 清洗吹干芯片后,利用芯片检测器,根据靶标分子检测方法的规定,采用标准样品所使用的常数和 给定方法的信号对测量获得的数据进行定量处理,得到样品参数(如,溶液浓度、质量面密度等) 8.5结果判定和分析 对于测定的量化结果,根据实际应用的要求,对其进行判定 在定性检测中,利用统计学中的ROc 曲线确定阴阳性临界值,并分析检测方法的效能 在定量检测中,采用标准曲线的方法实现检测结果与 靶标分子含量的确立
GB/T37908一2019 参 考文献 [1]Jin,G.,etal.(1995). Bionsensorconceptbasedonimagingellipsometryforvisualizatiom ofbiomolecularinteractions， AnalyticalBiochemistry232(1):69-72. Jin,G.,etal.1996 revisited:Developmentsforvisuallizationofthin “lmagingelipsometry ReviewofSeientificInstruments67(8):2930-2936 transparentlayersonsiliconsubstrates Status lin,G..2008).“Developmentofbiosensorbasedonimaging elpwometry.”Physiea Solidi DlicationsandMaterialsSeience205(4:810-816. a-Appl [4们 )metryandbio Jin,G.,etal.201l).“Developmentofbiosensorbasedonimagingellipso mediealapplications.”ThinSolidFilms519(9);2750-2757.

基于光学椭偏成像的无标记蛋白质芯片分析方法通则GB/T37908-2019解析

随着生命科学领域的不断发展，对于蛋白质芯片的需求越来越高。传统上，蛋白质芯片分析需要使用荧光标记等方法来标记蛋白质，但这些方法会对样品产生影响，并且费用也较高。因此，人们开始探索无标记蛋白质芯片分析方法。

光学椭偏成像是一种无标记分析方法，适用于蛋白质芯片分析。它利用蛋白质在金属表面的吸附和定向取向特性，在光学显微镜下直接观察蛋白质的形态和分布。而GB/T37908-2019则是基于光学椭偏成像的无标记蛋白质芯片分析方法的通则。

GB/T37908-2019包含了无标记蛋白质芯片制备、光学椭偏成像实验操作、数据分析等方面的要求和建议。在制备方面，需要注意样品的制备和芯片表面的处理；在实验操作方面，则需要根据样品和仪器的不同进行适当的优化；在数据分析方面，则需要注意信号的提取和处理。

与传统荧光标记方法相比，基于光学椭偏成像的无标记蛋白质芯片分析方法具有以下优点：

• 无需标记，样品完整性得到保留，避免了标记过程对样品的影响
• 具有较高的灵敏度和特异性，可以观察到微小的形态变化和分布情况
• 数据获取速度快，可以实现实时检测，并且费用较低

因此，基于光学椭偏成像的无标记蛋白质芯片分析方法在生命科学领域具有广泛的应用前景，特别是在蛋白质结构和功能研究、新药物筛选等方面具有重要意义。

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2022/7/28 2:49:56 现行