国家标准 GB/T28979一2012 欧芹壳针袍检疫鉴定方法 Deteetionandidentifieationofseptoriapetroselini 2012-12-31发布 2013-06-01实施国家质量监督检监检疫总局发布国家标准花管理委员会国家标准
GB/T28979一2012 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口本标淮起草单位;厦门出人境检验检疫局检验检疫技术中心本标准主要起草人:林石明、廖富荣、陈青,黄蓬英、陈红运、王宏毅、吴媛
GB/T28979一2012 欧芹壳针抱检疫鉴定方法范围本标准规定了欧芹壳针袍的检测和鉴定方法本标准适用于欧芹属种子苗木及其产品中欧芹壳针弛的检测和鉴定规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件件 GBy/T18085一2000植物检疫小麦矮化腥黑穗病菌检疫鉴定方法 s/T1809进出境植物种子检疫规程 sN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样欧芹壳针抱基本信息拉丁学名Seporiaperwelini(Lber)Desmazieres 中文名称;欧芹壳针弛属真菌界(Fungi),无性真菌门(Anamorphicfungi),未分目曾归为球壳袍目Sphaeropsidales),未分科(曾归为球壳抱科sphaeropsidaceae),壳针抱属(Septoria) 至今尚未发现其有性阶段欧芹壳针抱自然侵染欧芹(Petrselinumcrisbum)和莞萎(Coriandrumsativum),引起欧芹壳针袍叶斑病该病菌主要通过感染的种子进行远距离传播,种子是重要的初侵染源欧芹壳针抱的其他相关信息参见附录A 方法原理本标准通过分离培养,根据菌落形态特征,病原菌无性世代的分生抱子器、分生抱子梗和分生抱子的形态特征,结合病菌所引起的主要危害症状,对该病原进行鉴定主要试剂,仪器设备和用具 5.1主要试剂次氯酸钠,蔗糖,甘油,琼脂,酒精等 5.2仪器设备超净工作台,高压灭菌锅,光照培养箱,生物显微镜(20X400X)等 5.3用具白瓷盘,培养皿,酒精灯,吸水纸,载玻片,盖玻片,刀片,手术剪,锻子,尖头子,刷子,pH计,血球
GB/T28979一2012 计数板,塑料袋,离心管等抽样与检查按SN/T1809或SN/T2122规定的抽样方法进行抽样检查检查种子、苗木及其产品是否有病斑、小黑点(分生抱子器)等(参见附录A) 若有小黑点,直接切片在显微镜下检查受感染的叶片初为黄色小斑,随后变成浅黄色至黄褐色,最后为褐色的病斑病斑边缘颜色稍深,为坏死圈病斑圆形至长圆球形,或不规则,平均3mnm一8mm,最大的直径约13mm 边缘具窄的褐色的坏死线在叶柄上为卵圆形,暗褐色的小病斑叶面上病斑产生黑色小点(即分生抱子器) 在种子表面具黑色小病斑或小黑点病菌分离 7.1植物组织中病菌的分离 min5" 将植物组织用1%的次氯酸钠消毒21 min,用无菌蒸僧水冲洗,在无菌条件下晾干,放置在 PDA培养基上,于20C一25C下培养3d5d后,挑取菌落边缘菌丝进行纯化 7.2种子中病菌的分离 7.2.1洗涤检查称取50g或适量的种子,加无菌水100ml,在振荡器中振荡5min,取洗涤液在1000r/min离心 3min,弃上清液,在沉淀中加人适量(约1mL)的席尔氏液(配制方法见GB/T18085一2000的附录A) 悬浮,取1滴(约50AL)的悬浮液在显微镜下20×400×)检查 7.2.2分离培养检查异常的种子,挑取表面具有小黑点的种子,或随机挑取种子,每份样品至少检测400粒种子用蒸懈水将吸水纸充分湿润(避免产生多余的水),种子均匀置于吸水纸或PDA培养基上(如直径9cmm 的培养皿约25粒/m),加盖后,在20"c一22“c,在12h紫外光和12h黑暗下交替培养或者先在 20“c下培养24h,而后于-20"c冷冻24h 5d~7d后观察培养结果,挑取可疑菌落进行分离纯化病菌鉴定形态特征 8.1.1在PDA培养基上(见附录B),菌落糠毗状,呈暗褐色(参见图A.3) 从病组织或分离纯化所得的菌落挑取的分生袍子器,在立体显微镜下进行形态观察和切片(最好能够从孔口处切开),根据分生袍子器、分生抱子梗和分生袍子的形态特征进行鉴定 8.1.2分生抱子器埋生于表皮下或稍微突出,单室,球形至近球形,有些较扁,黄色至黑褐色,直径 55Am一200Am;具近圆形至椭圆形孔口,直径204m一40Am 分生抱子器壁由多角形的厚壁细胞所组成,厚壁细胞直径为3 um,黄色至褐色分生袍子梗短,瓶梗形,无色透明,从分生袍子器的 Am~5 内壁伸出,产袍方式为全壁芽生合轴式分生袍子具04个真隔膜,一般为1一3个隔膜,未成熟的可能没有隔膜,无色透明,线状或近圆柱形,.Om一1.5m)x(22 m51丝m),长宽比例大于10,通常稍微弯曲,基部钝圆而顶部渐尖参见图A.4一图A.6
GB/T28979一2012 致病性测定 8.2.1接种体制备刮取在PDA培养3d的可疑菌落的分生袍子,用无菌水配制成10CFU/ml~10'CFU/mL袍子悬浮液 8.2.2接种试验将欧芹种子播种于小盆钵中,每盆播种58粒种子,生长5周~7周,备用用刷子轻扫欧芹幼苗叶片进行创伤,将袍子悬浮液喷雾接种于欧芹的叶片上,每盆接种5株,重复二次用无菌水作空白对如可能,采用欧芹壳针抱已知菌株作阳性对照接种后用干净的塑料袋包扎封口,在饱和湿度,于照 0C下照暗中培养48h后,去掉塑料袋,在65%一70%的相对湿度下,移人培养箱,20`c- 25"C下黑暗中培养;注意观察，一般在14d后就产生典型的症状结果判定与样品保存结果判定 9.1.1未分离到可疑菌落病菌分离培养7d后,仍未产生可疑菌落,则未检出 9.1.2分离到可疑菌落分离培养后的可疑菌落,其形态特征如果符合8.1描述的鉴定特征,经致病性接种试验又产生典型的症状,而空白对照没有表现症状,则判定为检出;可疑菌落没有产生典型的症状,则判定为未检出记录及样品保存检测报告应包含所采用的病菌分离方法,包括菌落形态特征,致病性测定所产生的症状照片等供试样品和所分离到的菌种,应保存在低温冰箱中,以备复核
GB/T28979一2012 附录A 资料性附录欧芹壳针抱相关信息病原菌的名称 A.1.1中文名称欧芹壳针袍 A.1.2英文名称 leafblightofparsley,leafspotofparsley A.1.3拉丁学名 Septoriapetroselini(Libert)Desmazieres A.1.4同物异名 Septoriaaii(Briosi&.Cavara)RostrupsensuKleb Rostrup. punctiformisLaib. Dorogin gra7eolentis selin7DeSm aiRoum betroselini betroselinivar，abiiBriosi8.Cavara emacuulalaSac Septoriaetroselini 病原菌的分类地位属真菌界(Fungi),无性真菌门(Anamorphiefungi),未分目曾经归为球壳袍目Sphaeropsidales). 未分科(曾经归为球壳抱科Sphaerops sidaceae),壳针泡属(Seporia) 至今尚未发现其有性阶段 A.3寄主植物 A.3.1自然寄主欧芹壳针抱只发现侵染欧芹(Peroelinu.erisy)um)和芜萎(Coriandrwn L.),但不侵染 StiU 芹菜(Apiumgraveol le75 与之类似的芹菜生壳针袍(Seporiaapicola),不会侵染欧芹欧芹壳针泡引起欧芹叶斑病(亦称叶疫病),严重影响产量,影响种子的萌发率 A.3.2接种寄主至今未发现有接种寄主
GB/T28979一2012 A.4传播途径种子是初侵染来源病菌在干燥的病残体上可存活3年以上,种子中可存活2年以上,枯死叶片上也可存活几周种子上可见分生袍子器在大田,病菌通过雨水的飞溅风和人工或机械传带而扩散 A.5症状特征症状主要表现于叶片和叶柄叶片上初为黄色小斑,随后变黄褐色至浅黄色,最后为褐色病斑圆形至长圆球形,或不规则.平均3 mm8mm,最大约1.5cm 病斑边缘颜色稍深,边缘具窄的褐色坏死线在叶柄上为卵圆形、暗褐色的小病斑病斑上产生黑色小点(即分生抱子器) 参见图A.1和图 A.2 ycnidia pycnidind 图A.1在叶片上的症状图A.2在叶片病斑上的分生袍子器潮湿的气候有利于病害发生,发病率达40%80% A.6菌形态特征在PDA培养基上的菌落(参见图A.3),分生抱子器(参见图A.4),分生袍子器的孔口(参见图 A.5),分生袍子梗和产袍细胞及分生袍子(参见图A.6). 10Hm 图A.3在PDA培养基上的菌落图A.4分生抱子器的孔口引自lHager-IHoller,2002) 仿自lHagner-HHoler,2002)
GB/T28979一2012 1Om 图A.5分生袍子器孔口图A.6产抱细胞和分生袍子仿自Hagner-oller,2002) 仿自J.A.cooper) 与芹菜生壳针袍的区别 A.7 欧芹壳针袍与芹菜生壳针抱容易混淆,区别见表A.1 表A.1欧芹壳针抱与芹菜生壳针抱区别特征形态特征芹菜生壳针抱欧芹壳针袍球形至近球形，有些较扁黄色至黑褐色，直径叶面两面生或茎上生,散生或聚生,球形或扁分生抱子器 55Am一200m;具近圆形至椭圆形孔口，直球形,直径70m一100Am 径204m一404m 无色透明,线状或近圆柱形,0~4个真隔膜，一般为无色,针形,基部钝圆,1一6个隔膜,多数3一4 1一3个,(1.0 m)×(22m51m),长分生袍子 Am~l.5Am 个 ,(2.54m5.0m)×54m104m) 宽比例大于10 产抱方式内壁芽生瓶梗式(ebph 全壁芽生合轴式(hb -Sym A.8地理分布美洲,美国(夏威夷、佛罗里达等),加拿大;亚洲土耳其等;欧洲;德国,英国、法国、荷兰,意大利、罗马尼亚、乌克兰、波兰希腊、保加利亚、匈牙利、瑞士等;大洋洲;澳大利亚、新西兰等
GB/T28979一2012 B 附录规范性附录 PDA培养基的配制 B.1培养基配方马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂20g,纯净水1000ml B.2培养基配制将马铃薯去皮,洗净,称取200g,切成小块,放人1000mL水中煮沸20min,用双层纱布过滤,得到马铃薯汁,补足水分,再加人20葡萄糖和琼脂不断搅拌至琼脂完全融化,补充水量至1000mL.,再加热至沸腾,高压灭菌后使用或选用市售PDA培养基,加人琼脂和纯净水,高压灭菌后使用
GB/T28979一2012 参考文献 [1]白金铠.2003.真菌志.第十七卷球壳袍目壳二胞属壳针抱属.北京;科学出版社 [2] AgrieultureandHortieultureDevelopmentBoardUK),2010.Outdoorherbs;lntegratedl managementofparsleyseptoriaandcorianderbacterialblight,FinalReport2010,P13. [3]Best-practiceguidelinesforproteetedherbs,Septorialeafspot,http://www.proteeted herbs.org.uk. [4]CerkauskasRFandUyenakaJ.,1990 FirstReportofSeptoriaBlightofParsleyinOn ario,PlantD)is 74:1037. DavisRM andRaidR.N.,2002.CompendiumofUmbelliferouscropdiseases,APs [[5 Press，P24. [6]DesmazieresJBHJ.,1842.NoticesurseizeespecesdugenreSeptoria，recemment decouvertesenFrance，etlaplupartinedites MemoiresdelaSocieteRoyaledesSciences，de lAgricultureetdesArtsdeIille1842:94-103. & EIlisMB. [7刀 EIlisJ P.,1987 MierofungionlandPlants:AnldentifieationHandbook TheRichmondPublishingCoLtd. [8]FarrDF.,BillsGF.,ChamurisGP& RossmanA Y.,1989 Fun onplantsand Te nPhytopathologiealsociety.sL Pal. plantproductsintheUnitedstates APsPress TheAmeriean Minnesota USA. F97 GamlielA，andYardenO.,1998.DiversificationofdiseasesaffegC HerbCro ropsinlsrael cting AccompaniestheincreaseinHerbCropProduction. 26(1):53-58. Phytoparasi ssitica rHHoler Ha ,2002.O [10 S oeuremetandbiologyfse septoriapetroselinionparsley,Rheinis- agner stitutfurPIlanzenkrankheiten,Inaugural-Dissertation. dhenFriedrieh-wIhelms-Unmiversitat [11]HochmuthG. andMaynardD.N.，1999. ParsleyProduetioninFlorida:ln:G. .),VegetableProduetionGuideinFlorida,SP170,UniversityofFlorida，Gainesville Hochmuthed.)， p189-192. [12] Kurts andTokF M.,2006.lnluenceofinoculumconcentration,leafage,temperature anddurationofleafwetnessonSeptoriablightofparsley.CropProtection,25(6):556-561. 13 KurtS.,2003FirstreportofSeptoriablightofparsleycausedbySeptoriapetroseliniin theMediterraneanregionofTurkeyPlantDis ,87:99. LacyM.L ,BergerRD.,GirbertsonR.LandLittleEL ,1996Currentchallenges 14 incontrollingdiseasesofceleryPlantDis ,80:1084-1091. [15]SmithI.M.,DunezJ.,LelliottR.A.,PhillipsD.H andArcherS.A.,1988European handbookofplantdiseases,BlackwelSeientificPublications. [16 Mohammads E.,1990.IdentifieationstudyofparsleylatebightinNenevah province ,22:313-319. IraqMes Aeriec" :sopotamia,J.
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欧芹壳针孢检疫鉴定方法GB/T28979-2012

欧芹壳是一种重要的香料和药材，但因为其生长环境比较特殊，容易受到各种病害的侵袭，其中针孢病就是其中之一。为了确保欧芹壳的进出口贸易和种植业的健康发展，我国制定了GB/T28979-2012标准，规定了欧芹壳针孢的检疫鉴定方法。

1. 样品采集

在进行欧芹壳针孢的检测前，需要对样品进行采集和处理。样品的采集应该遵循一定的规范，以确保采集到的样品具有代表性，并且样品的数量也需要满足一定的要求。

2. 菌种鉴定

在样品采集后，需要进行针孢菌的鉴定。该标准主要包括了常规的菌种鉴定方法，如形态学观察、生理生化试验等。同时该标准还规定了PCR方法、ELISA方法等现代生物技术方法的应用。

3. 病原学检测

病原学检测是欧芹壳针孢检疫鉴定的核心部分。病原学检测主要包括对病原菌的检测和鉴定。该标准规定了不同样品类型下的病原学检测方法，并且对于各类样品的处理方法也进行了详细说明。

4. 结果判断

在进行完上述步骤后，需要根据检测结果来进行判断。该标准规定了判断标准和方法，以确保判断结果的可靠性。

总之，GB/T28979-2012标准提供了一套科学的、规范的欧芹壳针孢检疫鉴定方法。在欧芹壳进出口贸易和种植业中，严格按照该标准进行检测和鉴定，能够有效预防和控制针孢病的发生和传播，保障了欧芹壳产业的健康发展。