GB/T27538-2011
动物流感检测A型H1N1流感病毒中HA、NA的焦磷酸测序检测方法
Animalinfluenzadetection-MethodofpyrosequencingforHAandNAininfluenzaVirusA（H1N1）
- 中国标准分类号（CCS）B41
- 国际标准分类号（ICS）11.220
- 实施日期2012-03-01
- 文件格式PDF
- 文本页数11页
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动物流感检测A型H1N1流感病毒中HA、NA的焦磷酸测序检测方法
国家标准 GB/T27538一2011 动物流感检测A型H1N1流感病毒中 HA、NA的焦磷酸测序检测方法 Animalinluenzadeteetio一MethodofpyrosequencingforHAandNAin iinfuenzavirsAH1N1 2011-11-21发布 2012-03-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T27538一2011 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准由农业部提出 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口
本标准起草单位:山东出人境检验检疫局、检验检疫科学研究院
本标准主要起草人:徐彪、梁成珠、凌宗帅、张太翔、岳志芹、高宏伟、孙涛、方绍庆、林祥梅、韩雪清、 朱来华,张鹤晓单虎
GB/T27538一2011 动物流感检测A型H1N1流感病毒中 HA、NA的焦磷酸测序检测方法 范围 本标准规定了焦磷酸测序技术用于A型Hl1N1流感病毒及其墨西哥变异株中的HA和NA核酸 序列检测方法
本标准适用于A型HlN1流感病毒通用及A型HlN1流感病毒墨西哥变异株的核酸检测
规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件
凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出人境动物检疫采样 GB19489实验室生物安全通用要求 NY/T541动物疫病实验室检验采样方法 sN/T1193基因检验实验室技术要求 缩略语 下列缩略语适用于本文件
ATP;三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate) DNA;脱氧核糖核酸(deoxyribonuedleicacid) DEPC;焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate) PBSs;磷酸盐缓冲生理盐水(phosphatebelancedsolution) Pyrosequeneing;焦磷酸测序 RT-PCR;反转录聚合酶链式反应(reversetranseriptionpolytmerasechainreaction) RNA;核糖核酸(ribonucleicaeid Taq酶:TaqDNA聚合酶 原理 焦磷酸测序是通过测序引物和PCR扩增单链DNA模板杂交,与DNA聚合酶,ATP硫酸化酶、,荧 光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶和底物(APS,荧光素孵育,逐一加人四种dNTPs(dATP,dTTP,dCTP dGTP),如与模板配对,此dNTP与引物的末端形成共价键,释放焦磷酸基团(PPi);ATP硫酸化酶在 APS存在的情况下催化焦磷酸形成ATP,ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素转化,氧化荧 光素发出与ATP量成正比的可见光信号;光信号由电荷合检测器(CCD)收集并由软件转化为峰
每个光信号的峰高与反应中掺人的核苷酸数目成正比
ATP和未掺人的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸 酶降解,淬灭光信号,并再生反应体系
GB/27538一2011 试剂和材料 5.1除特别说明外,本标准所用试剂为分析纯或生化试剂,所有试剂均用无RNA酶污染的器具 用DEPC水处理)分装,实验用水符合GB/T6682的规定 5.2焦磷酸测序用引物(对)序列见附录A 5 3 AMV反转录酶
TaqDNA聚合酶
5.4 5 .5 PyroGoldsQAReagentsDNA序列分析试剂盒或其他等效试剂
5.
DNTP 5. 琼脂糖(电泳纯) 5.飞 三氯甲婉
5.9异丙醇
1070%乙醇;配制方法见附录B 5 55 .11DNA分子量标准品(100bp2000bp). 12裂解液;Tizol或其他等效总RNA提取试剂
5.13ps,配制方法见附录鼓 1410×PCR缓冲液;建议使用厂家提供,如需配制见附录B 5 .15电泳缓冲液;配制方法见附录B 5. 5.16澳化乙锭贮存液;用水配制成10mg/ml
5. .17电泳加样缓冲液;配制方法见附录B 5 18 磁珠悬液
仪器设备 6.1焦磷酸测序仪 焦磷酸测序仪96孔板
6 6.3真空吸附器
6.4PCR仪
6.5冷冻离心机(最大离心力120g以上》. 6.6微量移液器
6.7电泳仪 6.8紫外检测仪
6 1.5m
Eppendorf管
g 采样和样品制备 7.1采样 按照NY/T54和GB/T18088选取样品
样品处理和其他实验活动符合GB19489的有关规定
7.2样品处理 7.2.1鼻腔拭子 样品在混合器上充分混合后,用高压灭菌子将拭子中的液体挤出,3000g离心5min,取上清液
GB/T27538一2011 转人无菌的1.5mLEppendor管中,编号备用 7.2.2肌肉或组织脏器 取待检样品2.0g于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨,加10mlPBS混匀,4C 3000g离心15min,根据需要取上清液转人无菌的1.5mlEppendor管中,编号备用
7.3样本存放 制备的样本在2C8C条件下保存应不超过24h,若需长期保存应置一70C以下,但应避免反 复冻融(冻融不超过3次)
操作方法 病毒RNA的提取 8.1.1取灭菌的1.5mlEppendor管,编号
8.1.2用微量移液器向每管中各加人600AL
裂解液,分别加人被检样本、阴性对照、阳性对照各 200AlL.,混匀后再加人200L三氯甲婉,混匀器上振荡混匀30s
于412000g离心15nmin .1. 取与8.1.1相同数量灭菌的1.5mLEppendor管,加人一20C预冷的500AL异丙醇,做标 .3 记
吸取本标准8.1.2各管中的上清液转移至相应的管中,上清液应至少吸取500Al 8. .1.4于冷冻离心机上4C12000g离心15nmin,小心倒去上清,倒置于吸水纸上,吸干液体; 加人600l70%乙醇,颠倒洗涤
8.1.5于4C12000g离心10min,小心倒去上清,倒置于吸水纸上,尽量沾干液体,室温干燥
8.1.6加人10uLDEPC水,轻轻混勺匀,溶解管壁上的RNA,2000g离心5s,冰上保存备用
提取的 RNA应在2h内进行PCR扩增;若需长期保存须放置一70C冰箱 8.2RT-PCR扩增 8.2.1反转录 在3gAL
模板中分别加人2;L25mmol/几
Mg(Cl.，1L
10×PCR缓冲液，1 2 nol/L.dNTP,0.25l40U/alRRNA酶抑制剂,0.5AL
5U/AlLAMV反转录酶,0.5l. 5mmo 20pmol/L焦磷酸测序引物对(见附录A)中的RT-PCR上下游引物,用DEPC水补足体积至10L
瞬时离心混合
在PCR仪上进行反转录,条件为42C30min,98C1min,冷却到4C
8.2.2PCR反应 8.2.2.1PCR反应体系 在反转录后的10LcDNA溶液中加人10×PCR缓冲液5l,5U/lTaqDNA聚合酶 0.25L,20pmol/aL焦磷酸测序引物对(见附录A)中的RT-CR上下游引物各0.5l,DEPC水补 足体积至50nL,在CR仪上扩增
8.2.2.2PCR循环条件 8.2.2.2.1A型H1N1流感病毒HA基因:94预变性5min,94C变性30s,60退火30s 72C延伸30s,共循环45次;然后72C再延伸101 min
8.2.2.2.2A型HlN流感病毒NA基因:94预变性5" 1,94C变性30s,56C退火30s min，
GB/T27538一2011 72C延伸30s,共循环45次;然后72笔再延伸10min. 8.2.2.2.3A型HIN1流感病毒墨西哥株HA基因;94C预变性5min, ,94C变性30s,58C退火 30s,72C延伸30s,共循环45次;然后72C再延伸10min. 8.2.2.2.4A型HIlN1流感病毒墨西哥株NA基因;94C预变性5min,94C变性30s,55C退火 30s,72C延伸30s,共循环45次;然后72再延伸101 min 3 8.2. 对照系统 检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照
8 CR扩增产物电泳检测 在电泳槽中加人电泳缓冲液,使液面刚刚没过含有澳化乙锭的琼脂糖凝胶;将3L6ALPCR扩 增产物分别和适量电泳加样缓冲液混合,点样;以DNA分子量标准品做对照;9V/cm恒压电泳,直至 溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部;紫外检测仪下观察电泳结果并记录;扩增到目标片段的PCR产物用于 测序
8 焦磷酸测序 8.4.1测序单链模板的制备 8.4.1.1测序使用焦磷酸测序专用试剂盒或其他等效试剂
8.4.1.2在焦磷酸测序仪96孔板中每孔预先加人44L.退火缓冲液，lAlL20pmol/L测序引物 混匀
8.4.1.3混匀磁珠悬液,将需要使用的磁珠总量(按每样3AL)转移到一个1.5ml
Eppendor管中, 加人结合缓冲液,使得平均每样达50AL
8 .4.1.4将50AlL标记有生物素的PCR产物与50AL链霉亲和素包被的磁珠混合,在室温25C下振 荡孵育20 min 8.4.1.5用真空吸附器将与磁珠结合后的PCR产物吸起,然后在纯水中清洗30s;在70%乙醇中清 洗5s;变性缓冲液洗5s;最后移到洗涤缓冲液中清洗10s 8 .4.1.6真空吸附器放人含有焦磷酸测序引物的板中,摇动,释放磁珠
将样品放人80C烘箱2 min, 再冷却到室温
8.4.2测序反应 测序反应在28C下于焦磷酸测序仪上进行,加样使用600mb/8ms的加样压力和时间,每轮反应 时间65s
引物链随着不同dNTP的加人而延伸
随着核酸的结合,cCD摄像机检测到发出的光信 号,读出DNA序列
8.5结果判定 8.5.1A型H1N1流感病毒的确定 8.5.1.1H和NRT-PCR反应均为阳性的,进行焦磷酸测序分析,测序片段与Hl、NI目标片段完 全相同的,确定为A型HN流感病毒亚型
8.5.1.2H1和N1RT-PCR反应均为阳性的,Hl和N测序片段与目标片段有一个以上碱基不同定 为可疑,进行HA或NA基因全序列测定,确定其亚型和毒株,如为H1N1变异株,建议将其作为新序 列公布,以供其他诊断参考
8.5.1.3H1、N1RT-PCR反应全部或有一个为阴性的判定为非A型HN1流感病毒
GB/T27538一2011 8.5.2A型H1N1流感病毒墨西哥变异株的确定 8.5.2.18.5.1中确定为A型H1N1流感病毒的样品,建议采用A.2中的引物,按照8.1到8.4的程 序进行测序 8.5.2.2所得序列参照8.5.1中的方法,对照附录C中的A型HlN1流感病毒墨西哥变异株的目标 片段确定是否为A型HN流感病毒墨西哥变异株
检测过程中防止交叉污染的措施 按照SN/T1193要求执行
10 废弃物处理 检测过程中的废弃物,收集后在焚烧炉中焚烧处理
GB/27538一2011 附 录A 规范性附录 RT-CR及测序引物 A.1A型1N1流感病毒RI-CR及测序引物 H1基因上游引物(88p)5'-TTTGGCGATCTACTcCACAGTC3' 5'-AcCCATTAGAACACATcCAGAAGC-3 Hl基因下游引物 5'生物素标记 H1基因测序引物 5'-AGAACACATCcCAGAAGC-3' N1基因上游引物249bp5'-AATTGGCATGGCTCAAATCG3' N1基因下游引物 5'-TGGATcCCAAATCATCTCAAAA-3'" 5'生物素标记 N基因测序引物 5'-CGTTTAAATACGGCAAT-3' A.2A型H1N1流感病毒墨西哥变异株RI-PCR及测序引物 H1基因上游引物(86bp)5'-GAAGACAAGCATAACGGGAAAC-3 Hl基因下游引物 5'-AGGATcCAGcCAGCAATGTTAC-3 5'生物素标记 5'-CAAGCATAACGGGAAA-3 H1基因测序引物 NI基因上游引物(147bp5'-GGGAATCAAAATCAGATTGAAACA-3 5'-GGAATTGCCCGCTAATTTCA-3 N1基因下游引物 5'生物素标记 5'-CAACTTTGCTGCTGG-3 NI基因测序引物
GB/T27538?2011 ? B 淶?? ? B.170%? ?70mL????100mL B.2λ?? B.2.1A?(0.2mo/1?? ??(NaHPOH.O)27.6g,??,?1000mL B.2.2B?(0.2mol/L?? ?(NaHPO7H.O)53.6g,[??(Na;HPO12H.O) 71.6??(Na,HPO2H.O)35.6g]??,?1000m B.2.30.01mol/Lp7.2λ? 0.2nmol/LA? 14ml 0.2mol/LB? 36mL ? 8.5 ???1000mL B.310CR? 500mmol/LKCI 100 mmol/ITris-Cl(pH8.3,) 15mmol/LMgC 1.05kg/enm?10nmin??20C B.4? B.4.1?(50 Tris 242 g 57.1mL 100mL 0.5mol/LEDTA(pH8.0) ??1000ml B.4.2?? ?50??
GB/27538一2011 B.5澳化乙锭贮存液 取1g澳化乙锭加蒸圜水稀释定容至100ml.,磁力搅拌数小时,确保完全溶解
然后用铝箱包裹 容器或将溶液保存于棕色瓶中,于室温保存
B.6电泳加样缓冲液 0.25 澳酚蓝 g 蔗糖 40.0 g 加水稀释至100mL
GB/T27538一2011 附 录 C 规范性附录 已知亚型目标片段 A型H1N1流感病毒H1目标片段:GGGGGCAAT A型HIN1流感病毒NI目标片段;GGTGTTTGGATAGG A型HlN1流感病毒墨西哥变异株H1目标片段:TGCAAAcTAAGAGGGGTA A型HlN1流感病毒墨西哥变异株N目标片段;CAGTCAGTGGTT
动物流感检测A型H1N1流感病毒中HA、NA的焦磷酸测序检测方法GB/T27538-2011
随着全球化进程的加速以及人类活动范围的扩大，动物和人类之间的接触越来越频繁，因此动物流感的防控越来越受到关注。其中，A型H1N1流感病毒是一种常见的动物流感病毒，也是引发公共卫生事件的重要病原体之一。
为了更好地预防和控制动物流感疫情的发生，需要开发出高效、快速、准确的检测方法。目前，针对A型H1N1流感病毒的检测方法主要包括传统的病毒分离、血清学检测、分子生物学检测等技术。
其中，HA和NA是A型H1N1流感病毒的两个重要抗原决定位点，在病毒的识别和检测中具有重要作用。因此，采用焦磷酸测序技术对HA和NA进行检测，具有检测灵敏度高、特异性强、快速、可靠等优点。
针对这一需求，GB/T27538-2011标准就制定了适用于动物流感中A型H1N1流感病毒的HA、NA的焦磷酸测序检测方法。该标准主要包括样品采集、核酸提取、PCR扩增等步骤，并且对实验条件、仪器设备等方面也进行了详细规定。
通过实验证明，基于HA、NA的焦磷酸测序技术可以快速、准确地检测出动物流感中A型H1N1流感病毒，具有较高的检测灵敏度和特异性，可为动物流感疫情的防控提供重要的技术支持。
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