牛尿中玉米赤霉醇、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚残留量的测定液相色谱-串联质谱法

牛尿中玉米赤霉醇、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚残留量的测定液相色谱-串联质谱法

国家标准 GB/T20767一2006 牛尿中玉米赤霉醇、己烯雌酚 己浣雌酚、双烯雌酚残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 diethylstilestrul Meth0dfor”determinationofzearalanol， hexestrolanddien0estrolmulti-residuesinbowineurine LC-MS-MSmethod 2007-03-01实施 2006-12-31发布 国家质量监督检验检疫总局 发布 中 国国家标准化管委员会国家标准
GB/T20767一2006 前 言 本标准的附录A和附录B为资料性附录 本标准由秦皇岛出人境检验检疫局提出 本标准由国家质量监督检验检疫总局归口 本标准起草单位:秦皇岛出人境检验检疫局、天津出人境检验检 疫局 本标准主要起草人:庞国芳、许泓、林安清、古珑、何佳、张曼 本标准系首次发布的国家标准
GB/T20767一2006 牛尿中玉米赤霉醇、己烯雌酚 己炕雌酚、双烯雌酚残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 范围 本标准规定了牛尿中玉米赤霉醇,己烯雌酚、己婉雌酚、双烯雌酚残留量液相色谱-串联质谱测定 方法 本标准适用于牛尿中玉米赤霉醇、,已烯雌酚,己炕雌酚、双烯雌酚残留量的测定 本标准的方法检出限,玉米赤霉脖和己烧雕前为0.5pe/L.己婚雕丽和双希雕盼为1.0g/L. 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度正确度与精密度第1部分:总则与定义 (GB/T6379.12004,IsO5725-1:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第2部分;确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法(GB/T6379.22004,IS05725-2;1994,IDT) GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682-1992,neq1so3696.1987) 原理 免疫亲和柱内含有的特异性抗体选择性地与试样中己烯雌酚、,己婉雌酚、双烯雌酚和玉米赤霉醇结 合,形成抗体-抗原复合体,用水淋洗柱除去杂质,用洗脱剂洗脱吸附在柱上的目标物,收集洗脱液 试 液用液相色谱-串联质谱仪测定,保留时间和离子丰度比定性,内标法定量 试剂和材料 除另有说明外,所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水 甲醇:色谱纯 4.2乙醇:色谱纯 4.3乙睛:色谱纯 淋洗液:将Randox试剂盒》中提供的淋洗原液用去离子水按1:20稀释 4.5洗脱液:乙醇十水(70十30) 量取70ml乙醉(4.2)与30mL去离子水混合 储备液将Randox 试剂盒中提供的储备原液用去离子水按1:5稀释 免疫亲和层析柱;Randox或相当者 玉米赤霉醇免疫亲和层析柱;亲和柱的最大容量为l00ng玉米赤霉醇 4.7.2 二苯乙烯免疫亲和层析柱;亲和柱的最大容量为50ng己烯雌酚,50ng己婉雌酚,50ng )给出这一信息是为了方便本标准的使用者,并不表示对该产品的认可 如果其他产品能有相同的效果,则可使 用这些等效的产品
GB/T20767一2006 双烯雌酚 4.8激素标准物质;玉米赤霉醉(包括a-玉米赤霉醇和仔玉米赤霉醇,各50%),纯度>97%;己烯雌 酚,纯度>99%;己烧雌酚,纯度>98%;双烯雌酚,纯度>98% 4.9激素标准溶液;分别准确称取适量的玉米赤霉醇、己烯雌酚、己烧雌酚和双烯雕酚标准物质用甲 醉(4.1)配制成1.0mg/mL标准储备溶液 再根据需要以甲醇配制成不同浓度的混合标准溶液作为 标准工作溶液,保存于4C冰箱中,可使用三个月 内标标准物质;玉米赤霉醉-4爪代(包括a玉米赤霉醉-4爪代和p玉米赤霉醇-4爪代,各50%). 4.10 纯度>99%;己烯雌酚-8冗代,纯度>98% 4.11内标标准溶液准确称取适量玉米赤霉醇-4尔代和己烯雌盼-8尔代标准物质,用甲醇分别配制 成1.0mg/ml标准储备溶液 再以甲醇稀释成适用浓度的混合内标标准工作溶液,保存于4C冰箱 中,可使用三个月 4.12滤膜:孔径0.45Am 仪器 5.1液相色谱-串联质谱联用仪;配有大气压化学电离源 5.2离心机:转速大于3000r/min. 5.3氮气浓缩仪 5. 涡旋振荡器 4 试样的制备与保存 6.1试样的制备 取有代表性样品,制成实验室样品 试样分为两份,置于样品瓶中,密封,并做上标记 试样保存 6. 将试样置于2C8c下保存 测定步骤 基质混合标准溶液的制备 样品称取 取5个阴性牛尿样品,每个10mL,于50mL离心管中,3000r/min离心(5.2)15min 向5支 0mL试管中,分别加人不同量混合标准工作溶液(4.9),使玉米赤霉醇和已熔雌酚的浓度为 ml.25ng/ml;已烁雕酗和双婚雕酚的浓度为 1.25 ng/mL.3.》g/ml..5.0ng/l..12.5 ng 2.51 L.35n/mL.50uu/ml 再分别加人适量混合内标标准溶液(4.I) ng/mL、5.0ng/mL、10 ng/ml 使其浓度均为10ng/mlL 加人3ml离心后牛尿的上清液,涡旋5.4)30s溶解,待净化 1.2净化 7. 用15ml淋洗液(4.4)分两次预洗免疫亲和层析柱(4.7),流速不大于3mL/min 上样,自然流 速 用5mL淋洗液以不大于2mL/min的速度淋洗,等体积重复淋洗一次,再用5ml去离子水以不 大于2mL/min的速度淋洗 用4mL洗脱液(4.5)洗脱,流速不大于2mL/min,收集洗脱液 将洗脱 液在氮气浓缩仪(5.3)上于40C水浴中吹干,加人1mL流动相,涡旋30s溶解 溶液经滤膜(4.12)过 滤后,供液相色谱-串联质谱测定 试样溶液的制备 取经3000r/min离心15min后待测样品3mL于50mL离心管中,加人内标标准工作溶液,使其 含量均为2.04g/kg 按7.1.1和7.1.2操作
GB/T20767一2006 7.3空白基质溶液的制备 取经3000r/min离心15nmin后阴性样品3mL于50mL离心管中,按7.1.1和7.1.2操作 7.4测定 7.4.1液相色谱条件 1,150mm×4.6mm 色谐柱;2ZORBAXEclipseSBC ,3.5 1或相当者; a Am bb 柱温;25C; 流动相:乙晴十水(70十30); c d)流速;1.0mlL/min e 进样量;50L. 7.4.2质谱条件 离子化方式;大气压化学电离 a b)扫描方式:负离子扫描; 检测方式;多反应监测(MRM) c 离子源温度325C d 雾化气压力:0.1035MPa; 气帘气压力;0.0690MPa; 辅助气压力:0.2415MPa g 喷雾器电流:一5uA; h 电喷雾电压;一4500V; 定性离子对、定量离子对,碰撞气能量和去簇电压见表1 表1四种激素和两种内标物的定性离子对,定量离子对碰撞气能量和去簇电压 药物名称 定量离子对(m/:) 定性离子对(m/: 碰撞气能量/八V 去簇电压/V 35 321.1/277.2 -100 玉米赤霉醇 321.1/277.2 321，1/303.2 -35 一100 325.1/208.9 -36 100 玉米赤霉醇-4爪代 325.1/263. 325.1/263. -38 -100 267.0/222.1 40 -90 267.0/222. 己烯雌雕盼 267.0/237.1 40 -90 265.0/221.1 -35 -90 双烯雕盼 265.0/235.1 265.0/235.l -32 90 -75 269.0/119.0 一22 己烧雕酚 269.0/134.0 269.0/134.o -75 46 275.1/227.9 一40 -73 己烯雕酚-8爪代 275.1/245,0 275.1/245.0 40 -74 4.3液相色谱-串联质谱测定 4.3. 定性测定 每种被测组分选择1个母离子,2个以上子离子,在相同试验条件下,样品中待测物质和内标物的 保留时间之比,也就是相对保留时间,与混合基质标准校准溶液中对应的相对保留时间偏差在士2.5% 之内;样品谱图中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的混合基质标准校准溶液谱图中对应的定性 离子的相对丰度进行比较,若偏差不超过表2规定的范围,则可判定为样品中存在对应的待测物
GB/T20767一2006 表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 >50 >2050 >1020 <10 允许的最大偏差 士20 士25 士30 士50 7.4.3.2定量测定 在仪器最佳工作条件下,基质混合标准溶液(7.1)分别进样,以工作溶液浓度为横坐标,峰面积为纵 坐标,绘制标准工作曲线 采用内标法进行定量测定 样品溶液中玉米赤霉醇、己烯雌酚、己婉雌酚和 双烯雌酚激素的响应值应在工作曲线范围内 在上述色谱条件和质谱条件下,标准物质液相色谱-串联 质谱的多反应监测(MRM)色谱图,参见图A.1 本方法的添加回收率数据参见附录B 7.5平行试验 按以上步骤,对同一试样进行平行试验测定 7.6空自试验 除不称取试样外,均按上述步骤同时完成空白试验 结果计算 8 试样中被测物的测定结果可由数据处理系统按内标法自动计算,也可按式(1)计算 100o 会x是x会x导 X=c.×一 T000 式中 试样中被测物残留量,单位为微克每升(4g/L); 基质标准工作溶液中被测物的浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL); 试样溶液中被测物的色谱峰面积; 基质标准工作溶液中被测物的色谱峰面积; 试样溶液中内标物的浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL); 基质标准工作溶液中内标物的浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL); 基质标准工作溶液中内标物的色谱峰面积; 试样溶液中内标物的色谱峰面积; 样液最终定容体积,单位为毫升(mL); 量取试样溶液的体积,单位为毫升(mlL 注;玉米赤霉醇和己烯雌酚的峰面积或峰高值分别是其两异构体峰面积或峰高值的和 精密度 本标准的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的,重复性和再现性的值 以95%的可信度来计算 重复性 在重复性试验条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r,牛尿中四种激素的 含量范围及重复性方程见表3 如果差值超过重复性限,应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定 9. 再现性 在再现性试验条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R,牛尿中四种激素的 含量范围及再现性方程见表3
GB/T20767一2006 表3含量范围及重复性和再现性方程 化合物名称 含量范围/g/I 重复性限r" 再现性限R 玉米赤霉醇 0.25一5 lgr=0.9656lgm一l.0897 lgR=0.9625lgm-0.7128 已烯雕 g"=0.7192gm一0.2685 0.5一10 lgR=0.7883lgm一0.2926 双烯雌盼 g"=0.5312gm一0.3127 gR=0.7507lg"一0.2487 0.510 己炕雌盼 0.255 -0.2830 lgr= =0.7728gm一0.4185 gR=0.8698 lgm 注:m为两次测定结果的算术平均值
GB/T20767?2006 ? A ?? ?ù????,????? ?ù-4??-8????(NRM)?? ?ù,?,??????????ù-4?,?-8?? ???(MRM)??,?A.1 2.54 ?ù 321.1/277.2 2.28 1/min ?ù a 2.54 ?- 325.1/236.1 2.28 1/min b5 ?ù-4 2.97 ??267.0/222.1 3.25 1/mim ? 2.99 ?269.0/134.0 1/mim ?? d 2.94 ???265.0/235.1 1/min ?? 2.97 ?-e 257.1/245.0 3.25 1/mim ?-8 ?A.1?ù?????,????? ?ù-4??-8????(MRM)??
GB/T20767一2006 附录 B 资料性附录 收率 本方法中四种激素添加浓度及其平均回收率的试验数据,见表B.1 表B.1本方法中四种激素添加浓度及其平均回收率的试验数据 激素名称 添加浓度/(4g/I 平均回收率/(% 0.5 85.30 玉米赤霉醇 2.5 99.29 5.0 96.99 1.0 80,81 已娇雌酚 5.0 1o1.40 10.0 100.20 1.0 105.20 双烯雌酚 5.0 93.30 10.0 97.50 0.5 83.74 2.5 己烧雕盼 88.95 103.20