中国对虾苗种

中国对虾苗种

国家标准 GB/T15101.2一2008 代替GB/T15101.21994 对虾苗种 ChtneseshrimpSelings 2008-04-09发布 2008-06-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T15101.2一2008 前 言 GB/T15101《对虾》分为两个部分 -GB/T15101.1一2008对虾亲虾; GB/T15101.2一2008对虾苗种 本部分为GB/T15101的第2部分 本部分代替GB/T15101.2一1994《对虾养殖苗种》,主要变化如下 原标准名称《对虾养殖苗种》改为《对虾苗种》; 增加了术语对应的英文; 删除了弱苗率的定义和要求; 苗种规格的最低限由0.7c修改为0.8 cm; 增加了对苗种来源的要求; 增加了虾苗计数方法的内容; 增加了对主要病毒性疾病的检疫要求; 增加了苗种运输的内容; “涛拉综合症的检疫”(见附录A); 增加了规范性附录“ 增加了资料性附录"RNA的实验室操作要求"见附录B. 本部分的附录A为规范性附录,附录B为资料性附录 本部分由农业部提出 本部分由全国水产标准化技术委员会海水养殖分技术委员会归口 本部分起草单位;水产科学研究院黄海水产研究所 本部分主要起草人:张岩、陈四清、于东祥、李鲁晶 本部分所代替标准的历次版本发布情况为 -GB/T15101.2一1994
GB/T15101.2一2008 对虾苗种 范围 GB/T15101的本部分规定了对虾(Fenneropenaeuschinensi)苗种的规格、质量要求、检验方 法、检验规则和运输方法 本部分适用于对虾苗种的生产、销售和使用 规范性引用文件 下列文件中的条款通过GB/T15101的本部分的引用而成为本部分的条款 凡是注日期的引用文 件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分,然而,鼓励根据本部分达成 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本 协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本 部分 GB/T15101.1一2008对虾亲虾 NY5052无公害食品海水养殖用水水质 术语和定义 下列术语和定义适用于GB/T15101的本部分 3.1 规格合格率siequltiel rate 符合规格要求的苗种数占苗种总数的百分比. 3.2 体色异常率abnormalbody-colourrate 体色异常(如发白、发红、腹部色素细胞异常扩张等)苗种数占苗种总数的百分比 伤残率woundanddeformityrate 发育畸形或附肢和额角损伤的苗种数占苗种总数的百分比 3 ilness eedng 带病率 rate 患有能现场判别病症或附着有其他附着物的苗种数占苗种总数的百分比 3.5 死亡率deathrate 死亡的个体数占苗种总数的百分比 苗种质量要求 4.1苗种来源 由符合GB/T15101.1一2008规定的对虾亲虾繁殖培育的苗种,苗种体长不小于0.8cm. 4.2 各项指标要求 4.2.1外观 虾苗应规格整齐,体色正常,体表光滑,健壮、活力强,舀起后迅速伏底,搅动后有明显的顶流现象 4.2.2质量要求 苗种质量应符合表1各项指标的要求
GB/T15101.2一2008 表1对虾苗种质量要求 序 项目 指标 规格合格率/9% >95 体色异常率/% <1 伤残率/% <1 带病率/% 1 死亡率/% S0,03 对虾白斑病毒(wSSV 不得检出 涛拉综合症病毒TSV 不得检出 4.3苗种的检疫 应对苗种进行对虾白斑病(wSSV、涛拉综合症TsV检疫 虾苗计数方法 5.1带水容量法 将虾苗盛于已知容量的容器内,充分搅拌使虾苗分布均匀,用100ml200m的容器量取虾苗 逐尾进行计数,重复2次,计算3次的算术平均值,根据水体之比,算出整个容器中虾苗总数 5.2无水容量法 又称干量法,用塑料纱网或尼龙筛绢制成杯状漏斗容器,或用不锈钢薄板制成半圆形杯状漏斗瓢， 用此杯捞取集苗箱内的虾苗,逐尾进行计数,重复2次,计算每杯的算术平均值,按杯数计算出虾苗 总数 5.3重量计数法 用尼龙筛绢网袋捞取集苗箱内的虾苗滴水0.5nmin称其重量,重复3次,计算出每千克或每克虾 苗的尾数 6 检验方法 规格合格率测定 直接用直尺(精度1mm)测量虾苗从眼柄基部至尾节末端的长度,每次取样数不得低于30尾 体色异常率、死亡率、伤残率、带病率 活体直接观察,测死亡率每次取样数不得低于10000尾,测体色异常率、伤残率、带病率每次取样 数不得低于1000尾 6.3对虾白斑病的检疫 对虾白斑病病毒的检疫见GB/T15101.1一2008附录B的规定 涛拉综合症的检疫 涛拉综合症的检疫见附录A 检验规则 组批 以一个育苗池为一个检验批,销售前按批检验 7.2取样方法 每个检验项目随机取样3次,取3次结果的算术平均值 7.3判定规则 按第4章规定的各项指标判定苗种是否合格,有一项不达标即判定为批不合格
GB/T15101.2一2008 苗种的运输 8.1 苗种运输可采取帆布桶充气运输、塑料袋充氧运输 8.2气温20C左右,用帆布桶运输体长1.0cnm1.5enm的虾苗,运输密度可在15万尾/m~ 25万尾/m';规格30cm×30cm×75cm的塑料袋充氧运输,在水温20C24C时,每袋装水四分之 ,可运输0.8cm1.0cm的虾苗2.5万尾~3万尾,运输时间20h以内,成活率在90%以上 8.3运输用水与苗种培育用水的温差应小于3C,盐度差小于3 8.4运输应尽量在早晚进行,避免阳光曝晒和雨淋 8.5运输用水应符合NY5052的要求
GB/T15101.2一2008 附 录A 规范性附录 涛拉综合症的检疫 实验室操作要求 进行涛拉综合症检疫的实验室操作应满足附录B的要求 A.2RNA模板的提取 按不同大小的虾苗或感染期取不同组织样品0.1g左右,其中,对虾幼体、仔虾取完整个体 3em以下的幼虾取摘除虾眼的头胸部,较大的幼虾可取鳗区或数根鳗丝,怀疑为慢性期感染 的较大幼虾或成虾取对虾的淋巴器官 样品可暂时保存于一20C 所取样品在0C以下研磨混合均匀,取0.1g~0.5g置于1.5mL无菌微量离心管中,加人 b 0.5mL1mLTrizolIM试剂,用研磨棒研磨,然后置室温5min 加人0.2ml三氯甲熔,振摇混合15s,室温放置3nmin 于10000r/min离心5min. 仔细吸取上层水相,移至一支无RNA酶的微量离心管中 e 加0.5ml异丙醇,混匀,置室温10min f 10000r/min离心10min,倒去上清液 g 加人1nml无RNA酶的70%乙醇,振摇1min,再于10000r/min离心3min,小心倒去上 h 清液 敞口颠倒离心管,于室温晾干沉淀,加人20l100L无RNA酶的水溶解RNA沉淀,立即 用于RT-PCR或保存于一70C待用 A.3Rr-CR扩增 F1引物序列如下:5'-TCA-ATGAGA-GCT-TGGTcC-3 反应体系按照表A.1的规定,扩增程序如下;60°C保温5min,快速取出并短暂离心,继续在60C 保温30min进行逆转录反应,然后94C2min,再按94C45s,60C45s,40个循环;60C7min,最后 4C保温,PCR产物的电泳参照GB/T15101.12008中B.4进行 表A.1涛拉综合症RI-PCR扩增体系 试 剂 用量 终浓度 5×EZ缓冲液 5 AL 1×EZ缓冲液 醋酸(25mmol/I 2.5l. 2.5mmol/1 ANT (10mmol/L) 0.75AL 300Amol/L 0mol/儿引物:1 .15l. 0,464mol/1 0.46mol/L 10pmol/儿引物R .15l 无RNA酶的水 13.45l rTthDNA聚合酶(5U/4L 0.5AL 0.1U/al 0.5Al RNA模板 反应总体积 24.5L
GB/T15101.2一2008 结果判定 A.4.1阳性对照在213bp处会有一条特定条带出现;阴性对照在213bp处不出现条带,以无菌水为 模板设立的空白对照不出现任何条带 阳性对照在213bp处无特定条带出现或阴性对照在213bp处 有条带出现都表明RT-PCR失败 注1:阳性对照为已知受TSV感染且RT-PCR结果显示明显阳性的样品RNA模板,一70C保存 注2;阴性对照为已知未受TsV感染且RT-PCR结果显示阴性的对虾组织RNA模板，一70C保存 注3;空白对照为无RNA酶的水作模板 A.4.2条带的亮暗表示扩增产物浓度的多少,但并不对应于模板的量的多少 A.4.3样品的电泳结果参照阳性对照和阴性对照组进行判读 在213bp有条带出现表示样品检测结 果为阳性,在213p无条带出现表示样品检测结果为阴性 A.4.4阳性结果表明被检样品中存在TsVRNA 对活虾和敏感宿主而言,提示已受TsV感染
GB/T15101.2一2008 B 附 录 资料性附录 RNA的实验室操作要求 B.1一般介绍 在RNA操作过程中,应注意RNA酶的活性 由于RNA很容易被RNA酶降解,而RNA酶又具 有很强的稳定性,且广泛存在,因此在操作中要严格防止RNA酶污染,并设法抑制其活性 RNA酶的污染包括内源性的和外源性的 内源性的RNA酶污染是指来自于样品组织本身的RNA酶或生化试剂本身的RNA酶 消除方 法主要是在RNA抽提和操作过程中使用RNA酶变性剂,如用异硫氮酸呱、酚、三氯甲烧等抽提使 RNA牌空性灭活使用A阁柳制前,如N随蹦的活性受到9制 外源性的RNA酶污染是指来自于水,玻璃制品、塑料器皿、电泳槽、操作人员和微生物等 可通过 焦乙酸二乙酯(DEPC)、三氯甲炕、干热烘烤等消除 本附录主要介绍外源性NA酶的消除方法 注意:DEPC,酚和腻盐等有毒或有腐蚀性,应避免吸入、吞食和沾着皮肤,处理DEPC和三氯甲婉 的操作均应在通风橱内进行 B.2溶液配制 直接用于RNA操作的所有水或无机盐溶液都应加人DE:PC至0.1%,搅拌12h,然后经高压燕汽 灭菌15min 不能用DEPC处理的试剂如含有Tris的溶液)或者不能经高压蒸汽灭菌的试剂,应用经 DEPC处理的水配制,然后经无RNA酶的0.22m微孔滤膜过滤除菌 B.3玻璃制品 玻璃器皿洗净后,在300C烘烤4h可彻底除去器皿上沾污的RNA酶 由于烘烤温度高,不能用 任何在300C下可燃烧、变性或融化的材料包裹器皿 金属制品也可按玻璃制品的办法处理 B.4聚丙烯塑料制品 聚丙烯塑料制品可在通风橱内用三氯甲熔漂洗,晾干后再经高压蒸汽灭菌,最后烘干 也可在加有 0.1%DEPC水中浸泡12h,然后经高压蒸汽灭菌,最后烘干 无RNA酶的一次性塑料制品,如塑料离心管、PCR管、枪头等也可购买直接使用 B.5电泳槽 许多电泳槽由有机玻璃或聚苯乙烯材料制成,不能用三氯甲婉处理,也不能经高压燕汽灭菌 可用 去污剂洗涤,水冲洗后用乙醇干燥,再浸泡于3%H.O中,室温下放置10nmin,然后用含0.1%DEPc 的水冲洗电泳槽,晾干并做上标记,供RNVA专用 RNA经过RT-PCR后,产物已变成DNA,电泳时并不需要对其电泳槽进行无RNA酶处理 B.6人工操作 处理RNA的全部操作应戴塑料或乳胶的一次性手套,同时应避免因交谈或其他活动造成的飞沫、 落尘带人RNA酶的污染,必要的情况下戴口罩和实验帽,或在超净台中进行操作 B.7防微生物污染 所有接触RNA的试剂和材料都应保持无菌,一旦有微生物污染或生长都应丢弃