国家标准 GB/T28081一2011 烟草环斑病毒检疫鉴定方法 Detectionandidentifieationoftobaccoringspotvirus 2011-12-30发布 2012-06-01实施国家质量监督检监检疫总局发布国家标准花管理委员会国家标准
GB/T28081一2011 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口本标淮起草单位厦门出人境检验检疫局、上海出人境检验检疫局,深圳出人境检验检疫局、江苏出人境检验检疫局本标准主要起草人:陈青、林石明杨翠云、张毅、陈红运、廖富荣、郑云,李斌
GB/T28081一2011 烟草环斑病毒检疫鉴定方法范围本标准规定了烟草环斑病毒检疫鉴定的基本原则和方法本标准适用于可能携带烟草环斑病毒的种子将苗木,鳞球茎、组培苗等繁殖材料及其产品的检疫鉴定规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 SN/T1146植物检疫烟草环斑病毒检鉴定方法烟草环斑病毒基本信息中文名;烟草环斑病毒学名;tobaccoringspotvirus 缩写:TRsv 属豇豆花叶病毒科Comoviridae,线虫传多面体病毒属Neoeirus病毒 TRsV的传播途径多样,可以通过种子,嫁接、机械接种和介体传播烟草环斑病毒其他信息参见附录A 方法原理利用基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定(DAsELISA)、体外反转录和体外DNA合成技术的反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)进行检测鉴定仪器设备、用具及试剂 5.1仪器设备洗板机、酶联检测仪,高速冷冻离心机、电子天平感量0.001g)、超净工作台,旋涡混合仪、,PCR 仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪、榨汁机、水浴锅 5.2用具微量移液器(0.5L,2AL,10AL,20ML,100L.200AL,1000L),化学PCR反应管和(或)96孔光化学PCR反应板,酶联板,研钵 5.3试剂双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂(见B.l)
GB/r28081一2011 反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测试剂(见C.1. 实时荧光RT-PCR检测试剂(见D.l) IC-RT-PCR检测试剂(见E.1) 种苗的检测鉴定 6 种子检测鉴定挑取500粒种子重点挑取畸形,不成熟的种子)播于灭菌土中,待长出3片4片叶后将表现症状的植株编号,未表现症状的植株分组(10株为1组)并编号采集的叶片分成两份,分别用于酶联测定和分子生物学检测也可以挑取畸形、不成熟的种子直接进行酶联测定和分子生物学检测 6 苗木、组培苗检测鉴定有症状的苗木单独检测没有症状的分组检测,分组方法和检测方法同6.1 6.3鳞球茎检测鉴定取鳞球茎的小芽或鳞片进行酶联测定和分子生物学检测植物产品的检测鉴定 6. 植物产品有症状的部分单独检测没有症状或无法的观察症状的植物产品,应按比例取样,检测方法为酶联测定和分子生物学检测检测双抗体夹心酶联免疫吸附测定把制备的样品上清液加人已包被TRsV抗体的96孔酶联板中,进行DAsELIsA检测,每个样品平行加到两个孔中健康的植物组织作阴性对照,感染TRsV的植物组织作阳性对照,样品提取缓冲液作空白对照,其中阴性对照种类和材料(如;种子或叶片)应尽量与检测样品相一致具体操作见附录B 7.2RT-PCR检测分别提取样品和对照的总RA,反转录合成cDNA后,进行PCR扩增健康的植物组织作阴性对照,感染TRsV的植物组织作阳性对照,超纯水作空白对照具体操作见附录C 7.3实时荧光PCR检测分别提取样品和对照的总RNA,反转录合成cDNVA后,进行实时荧光PCR检测健康的植物组织作阴性对照,感染TRSV的植物组织作阳性对照,超纯水作空白对照具体操作见附录D. 7.4IC-Rr-CR检测把制备的样品上清液加人已包被TRSV抗体的离心管中,然后进行ICRT-PCR扩增健康的植
GB/T28081一2011 物组织作阴性对照,感染TRSV的植物组织作阳性对照,超纯水作空白对照具体操作见附录E 结果判定 7.1、7.2、7.3、7.4中如果两种方法的检测结果为阳性,即可判断该批种苗携带烟草环斑病毒般是酶联测定为阳性后,分子生物学检测为阳性即可判断为携带有烟草环斑病毒必要时可进行生物接种试验,具体操作按照SN/T1146规定的方法执行样品保存、结果记录与资料保存样品保存经检验确定携带烟草环斑病毒的样品应在合适的条件下保存,种子保存在4C,病株在一20C或 -80C冰箱中保存,做好标记和登记工作都结果记录与资料保存完整的实验记录包括;样品的来源、种类、检测时间、地点、方法和结果等,并要有经手人和检测人员的签字酶联测定应有酶联板反应原始数据,RT-PCR检测应有扩增结果图片,生物学接种应有症状照片
GB/r28081一2011 附录A 资料性附录烟草环斑病毒简介 A.1寄主范围 TRsv自然寄主范围非常广泛,可侵染54科300多种植物.主要的经济作物有:大豆(Glycine ),马铃薯Sola berswm、甘薯Ipome oeabaaas)、烟草Nicolid ianatabacum、西瓜 .Z 711tub6 Citruulluslanatus 黄瓜(Cue uu1issatiuu.s s) ,甜瓜(cu ccunisel elo),胡萝卜Dut Lucuscrola 、 ,唐酉蒲 Gladiouscummunis),李属(Prn L.),葡萄(Vitisini/era)等 uuu.s A.2病害症状因寄主不同可产生不同的症状，一般在生长季节初始,幼嫩植株上的症状较严重,而在生长季节后期不太明显 TRsV造成叶片系统褪绿斑,坏死环斑,茎顶枯,根腐烂,危害严重时导致植株矮化,结果少和果实变小畸形有的症状在后期可恢复,表现为无症带毒大豆顶芽卷曲(芽枯萎),其他芽逐渐变褐色且易碎在茎干和多数叶片的叶柄上产生褐色条纹豆荚不发达且结实在结荚后感染则可能产生黑色污点烟草:在叶片上产生环形及线状斑,植株矮化葫芦;植株矮化、叶片斑驳,果实畸形葡萄;新长出的枝条柔弱、,稀疏,节间变短叶小且扭曲,植株矮小、产果少且变形 A.3分布地区 TRsV在日本、韩国、印度、台湾地区、美国、土耳其,加拿大、墨西哥,阿根廷、巴西、澳大利亚、新西兰等50多个国家和地区均有分布 A.4传播途径 TRsV在大豆上的种传率有时可达到100% 主要的传插介体为美洲剑线虫Xiphimema aer canum 此外在实验室条件下确定能传播TRSV的昆虫介体有许多,如烟蓟马Thripstabaci和烟草跳甲Epilrirhirtipennis等 A.5血清学特性 TRsV免疫原性强粒体形态病毒粒体为等轴二十面体球状颗粒,直径约28nn nm
GB/T28081一2011 基因组病毒基因组含两条ssRNA RNA-1长7514nt,RNA-2长3929nt,外壳蛋白基因1548 nt
GB/r28081?2011 ? B 淶?? ??? B.1? B.1.1 ???塣 B.1.2?? ????? B.1.3 (pNPP) B.1.4???(pH7.4 4 PBST NaSO. 1.3g 20g PVP(Mw2400040000) NaN 0.2g Na(OHHclpH?7.44C B.1.5?(pl19.6) NagCO. 1.59g NaHCO 2.93g NaN 0.2" 900mL???,HCIpH?9.6,?1L4C档 B.1.6PBsT?(???p7.4) NaCl 8.0g Na,HPO) 1.15g KHP(O 0.28 KCIl 0.2g Tween-20 0.5m 900mL???,NaOHHclpH?7.4,??1L ?PBSм0,5mLTween-20 B.1.7?????(plH7.4) PBST BsA(???)??2.0g
GB/T28081一2011 PVP(MW2400040000 20.0g NaN 0.2" 用NaOH或HCI调节pH值到7.4,4C储存 B.1.8底物(pNPP)缓冲液(pH9.8) MgC！ 0.lg NaN 0.2g 97ml 二乙醇胺溶于800mL蒸榴水中,用HCI调pH值至9.8,蒸溜水定容至1L 4C储存 B.2程序 B.2.1包被抗体用包被缓冲液将抗体按说明稀释,加人酶联板的孔中,l00AL/孔,加盖,室温避光孵育4h或4C冰箱孵育过夜,清空酶联板孔中溶液,PBST洗涤4次6次 B.2.2样品制备待测样品按1;10(重量;体积)加人抽提缓冲液,用研钵研磨成浆,2000r/min,离心l0min,上清液即为制备好的检测样品样品提取缓冲液作空白对照,阴性对照、阳性对照作相应的处理或按照说明书进行 B.2.3加样加人制备好的检测样品空白对照、阴性对照,阳性对照,100L/孔,加盖,室温避光孵育2h或4 冰箱孵育过夜,清空酶联板孔中溶液,PBST洗涤4次一6次 B.2.4加酶标抗体用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度,并加人到酶联板中,100L/孔,加盖，室温避光孵育2h,清空酶联板孔中溶液,PBST洗涤4次一6次 B.2.5加底物将底物八NPP加人到底物缓冲液中使终浓度为1mg/mL(现配现用),按100aAL/孔,加人到酶联板中,室温避光孵育 B.2.6读数用酶联检测仪在30min、lh和2h于405nm处读OD值 B.3结果判断 B.3.1对照孔的OD值(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔),应该在质量控制范围内,即缓冲液孔和阴性对照孔的oD值<0.15,当阴性对照孔的oD值<0.05时,按0.05计算阳性对照有明显的颜色反应;阳性对照oD值/圆性对照oD，值>2;孔的重复性基本一数 B.3.2在满足了B.3.1质量要求后,结果原则上可判断如下
GB/r28081一2011 样品OD值/阴性对照OD值明显>2,判为阳性样品OD值/阴性对照OD)值在阀值附近,判为可疑样品,需重新做一次,或用其他方法加以验证样品OD值/阴性对照OD值明显<2,判为阴性若满足不了B.3.1质量要求,则不能进行结果判断
GB/T28081一2011 c 附录规范性附录 RT-CR检测 C.1试剂 C.1.1TRIlzolreagent、三氯甲烧、异丙醉醇、70%乙醉 C.1.2反转录试剂M-MLV反转录酶(200U/L)、5×RT反应缓冲液250mmol/LTris-HCl umalL.DrT),aNTP混合液(各10mn mol/L plH8.325C,375mmol/LKCl,15mmol/LMgCl,50mr RNaseInhibitor(40U/pL). c.1.3PCR试剂;10×PCR缓冲液(含15mmol/L的Mg+、TaqDNA聚合酶(5U/aL),dNTP混合液(各10mmol/L). C.2实验步骤 C.2.1引物设计根据已报道的TRSVCP基因的保守序列设计1对特异性引物引物序列为:TRSVF-1:5'-GATGCAAAGAAAGGAAAGC-3’ TRSVR-1:5’-AGATATGGACAACATGGAG3’ 扩增片段大小为576bp C.2.2RNA提取 C.2.2.1取0.lg样品,液氮研细,加人1mLTRILzolreagent,混匀,倒人1.5mL离心管中,室温静置 3min C.2.2.2加人0.2mL三氯甲婉,剧烈振荡15s,室温静置3min,4C11000r/min离心10min,小心吸取上层无色水相到新离心管中 c.2.2.3加人等体积异丙醇,混匀,一20C静置10min,4C12000r/nmin离心15min,弃上清液 c.2.2.4加人1ml70%冷乙醇,悬浮沉淀,4C8000r/min离心10nmin,干燥沉淀 C.2.2.5加人30lDEPC处理的ddH,(O,溶解沉淀必要时,55C60C水浴10min,加速溶解). 于一80C保存备用注，也可按照商品RNA提取试剂盒进行操作 c.2.3反转录利用提取的RNA在PCR管中进行反转录先加人2aL的总RNA、1aL的TRsVR-1引物 10umol/I),于95C的水浴中7min,然后迅速冰浴5min 继续加人5×RT缓冲液2.5nlL,dNTP混合液(10mmol!/L)0.5l、M-MLV反转录酶(200U/aL)0.5AL、RNaseInhibitor0.5Al、,DEPC处理的ddH.O5.5l 反应参数:37C60min,95C10min 合成的cDNA于一20C冰箱保存备用 C.2.4PCR扩增 PCR反应体系见表C.1 反应条件:944min; 94C45s,48C45s、72C45s,30个循环;72g 延伸10min
GB/r28081一2011 表C.1PCR反应体系加样量称从L 10×PCR缓冲液(含15mmol/1的Mg 2.5 dNTP混合液(各10mmol/L 1.0 TRSVF-1(20o 0.5 mlAL TRSVR-1(20pmol/AL) 0.5 Ta酶(5U/ML 0.3 DNA 补ddH.0至25Al C.2.5琼脂糖凝胶电泳检测 C.2.5.1制备凝胶配制1.5%质量浓度)的琼脂糖凝胶澳化乙锭可直接加人琼脂糖凝胶中(浓度为0.5g/mL). 也可在电泳完成后用澳化乙锭染色 C.2.5.2电泳用1L6×加样缓冲液与5样品混合,然后将其和适合的DNA相对分子质量标准物分别加人到琼脂糖凝胶孔中接通电源,以3V/cm5V/em电场强度进行电泳,约0.5h后观察结果 C.2.5.3结果观察电泳结束后,将琼脂糖凝胶放人装有0.54g/L的嗅化乙锭(EB)溶液的容器中染色,然后在清水中清洗后,置于紫外透射仪上观察,拍照并保留结果 C.3结果判断阳性对照在576bp左右处有扩增片段,阴性对照和空白对照无特异性扩增,样品出现与阳性对照 -致的扩增条带,可判定为阳性阳性对照阴性对照和空白对照正确,样品未出现与阳性对照一致的扩增条带,判定结果为阴性 10
GB/T28081一2011 附录D 规范性附录实时荧光RT-PCR检测 D.1试剂试剂见C.1 D.2实验步骤 D.2.1引物设计引物序列 TRSV-5P:5'-TCCATGT'TGTCCATATCT'TA-3’ TRsVv-3P5'-AGAAGAAAcAcTcTTGAcAcT-3" 探针序列 5'-FAM-CCGCT'TATAGTGCCAGACCA-TAMARA-3’ D.2.2RNA提取及反转录操作方法见C.2.2. D.2.3实时荧光PCR反应体系实时荧光PCR反应体系见表D.1,每个样品设2个平行处理并设阳性对照、阴性对照和空白对照,以含有烟草环斑病毒的cDNA为阳性对照;以健康植物材料或线虫传多面体病毒属其他病毒的 cDNA作为阴性对照;以ddH.O代替DNA模板作为空白对照每个对照各做2个平行管表D.1实时荧光PCR反应体系加样量终浓度名称贮备液浓度 l PCR缓冲液 10 TRSV-5P 20Amol/I 0.24Mmol/1 0.6 TRsV-3P 0.6 0.24mol/1. 204mol/L 5U/aL 2U/test Tuq刚探针 204mol/L 0.44mol/L cDNA ddH.O 补ddH.O至50Al D.2.4实时荧光CR反应参数反应条件:94C5min;94C15s,55C40s,72C40s,共40个循环点击运行,进行PCR反应 1l
GB/r28081一2011 保存文件,打开分析软件,仪器自动分析试验结果,给出ARn(荧光信号增加值)与循环数之间关系的图像 D.3结果判定检测样品的Ct值大于或等于40时,则判定烟草环斑病毒阴性检测样品的C值小于或等于35时,则判定烟草环斑病毒阳性检测样品的ct值小于40面大于35时,应重新进行测试,如果重新测试的ct值大于或等于40时则判定烟草环斑病毒阴性;如果重新测试的c值小于40,则判定烟草环斑病毒阳性 12
GB/T28081一2011 附录 E 规范性附录 IC-RTI-PCR检测 E.1试剂 E.1.1TRSV抗体 E.1.2样品抽提缓冲液(见B,1.4) E.1.3包被缓冲液(见B.1.5) E.1.4PBST缓冲液(见B.1.6) E.1.5反转录及PCR试剂见C.1.2,C.1.3) E.1.6AMV反转录酶 E.2实验步骤 E.2.1引物引物序列见C.2.1 E.2.2抗体吸附将TRsV抗体用包被缓冲液作适量稀释,吸取200L.包被离心管,37C,孵育2h;用PBsT沈 3次,取样品50mg,加人样品抽提缓冲液进行研磨,吸取100Al包被PCR管,4C过夜(或37C孵育 2h);PBST洗3次,DEPC-HH.O洗1次,短暂离心后吸去管底余液 E.2.3反转录直接在吸附了病毒的PCR管中进行反转录反转录体系总体积20L,其中1山L反向引物 (204molL),4L5×AMV酶缓冲液,2LdNTP(10mmolL),11LDEPC-HO 离心混匀后 5七变性5nmin,退速置冰上2mim一了mim,然后加人lLAMV反转录脾(5U/pL)lL.RNA酶抑制剂(40U/l),42C反应1h E.2.4PCR扩增和琼脂糖凝胶检测操作方法见c.2.4.C.2.5 E.3结果判断阳性对照在576bp左右处有扩增片段,阴性对照和空白对照无特异性扩增,样品出现与阳性对照 -致的扩增条带,可判定为阳性阳性对照、阴性对照和空白对照正确,样品未出现与阳性对照一致的扩增条带,判定结果为阴性 13

烟草环斑病毒检疫鉴定方法GB/T28081-2011

烟草环斑病毒是引起烟草、茄科等植物感染的一种常见病毒，会导致病株生长不良、叶片黄化、萎蔫等症状。为了遏制该病毒的传播，需要进行有效的检疫鉴定。

鉴定方法

根据GB/T28081-2011标准，烟草环斑病毒的检疫鉴定可以采用以下方法：

ELISA法：利用酶标记抗体对病毒进行检测。
RT-PCR法：通过逆转录聚合酶链反应检测病毒的RNA。
Western blotting法：将病毒蛋白质进行电泳分离，再用特定抗体进行检测。

这些方法都具有高度的灵敏度和准确性，可以对烟草环斑病毒进行快速、有效的检测鉴定。

标准GB/T28081-2011

该标准规定了烟草环斑病毒的检疫鉴定方法及其操作要求，其中包括样品采集、处理、试剂准备、实验步骤等内容。该标准的制定和实施，可以为烟草和茄科作物的种苗生产、盆栽育苗、大田栽培以及进出口商品的检验提供技术标准。

结论

烟草环斑病毒是一种危害严重的植物病毒，其检测和鉴定具有重要意义。GB/T28081-2011标准规定了多种检测方法，可以根据具体情况选择合适的方法进行鉴定。希望本文能够为相关从业人员提供帮助。