国家标准 GB/T31808一2015 向日葵白锈病菌检疫鉴定方法 DeteetonamdidentfeatonoftAMbugotragopogonis(Pers.)s.F.Gray 2015-07-03发布 2015-11-27实施国家质量监督检验检疫总局发布国家标准化管理委员会国家标准
GB/T31808一2015 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口本标准起草单位;新疆出人境检验检疫局、新疆生产建设兵团农业技术推广总站本标准主要起草人:张祥林、王、赵冰梅、王文正、张江国、乾义柯
GB/T31808一2015 向日葵白锈病菌检疫鉴定方法范围本标准规定了向日葵白锈病菌的检疫鉴定方法本标准适用于向日葵种子和植株中向日葵白锈病菌的检疫和鉴定仪器和用具生物显微镜、体视显微镜、超净工作台、高压灭菌器、高速离心机、制冰机、全温水浴、PCR扩增仪电泳仪、凝胶成像仪、往复式振荡器、培养皿、烧杯、酒精灯、三角瓶、载玻片、盖玻片、慑子剪刀、量筒、吸管试剂乳酸、苯酚、甘油、棉蓝、藏红花、次氮酸钠(NacIo),十二熔基硫酸钠(SDS),三胫甲基氨基甲烧-盐酸(TieHc).氨化镇(MecCl),乙二股四乙酸四钠盐(EDTA,氢氧化销(NaoH),醋酸钠(NaOAe, 氯化钾(KCl),十六熔基三甲基澳化铵(cTAB),无水乙醇(Ethanol),苯酚(Phenol),三氯甲婉(Chloro orm),异丙醉(Iopropano),异戊醉(Ioamylalcohol)核酸染料(sYBRGreenI),蛋白酶K,Tug DNA聚合酶(TaoDNApolymerase)，脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP),DNA分子量标记(DNA Marker),TAE电泳缓冲液(TAEbuffer) 检疫鉴定方法田间症状检查 4.1 在向日葵现蕾中期至盛花期,到向日葵隔离种植区或大田进行调查,观察向日葵植株发病情况 4.2种子带菌检查选取5只瘪小的向日葵种子,置于干净三角瓶中,加人200m清水和少量洗衣粉,在往复式振荡器上振荡10min,倒去洗涤液,再加人等量的清水,重复洗涤3次5次,直至洗净向日葵种子上的种衣剂如无种子包衣,可省略此步),晾干,剥开向日葵种子,将果皮和种仁一起放人装有乳酚油的烧杯中,酒精灯下煮沸3min,冷却后在解剖镜下用锻子剥取内果皮和种皮,放人一干净培养皿中,加人少量棉蓝藏红花染色液,静置5h左右,用95%乙醇清洗后,用毁子夹取内果皮或种皮置于载玻片上,加一滴乳酚油作浮载剂,盖片镜检 4.3病原菌形态观察用干净刀片刮取少量向日葵病叶背面(或叶柄、花盘等)的白色瘪斑中的病菌,置于载玻片上,在生物显微镜下观察该病菌形态特征,记录抱囊梗、抱子囊、卵袍子的形状及大小将制备的向日葵内果皮或种皮玻片,置于生物显微镜下观察病菌形态特征,记录抱囊梗、抱子囊、卵抱子的形状及大小
GB/I31808一2015 4.4分子生物学检测 4.4.1NA提取取向日葵种子或具疑似症状的向日葵病组织,用cTAB法或试剂盒法提取核酸(见附录B) 4.4.2巢式CR检测向日葵白锈病菌的巢式PCR检测方法见B.2 4.4.3实时荧光CR检测向日葵白锈病菌的实时荧光PCR检测方法见B.3 鉴定特征 5.1为害症状向日葵受白锈病菌侵染为害后,在叶片正面产生淡黄色或淡绿色病斑,直径1mm2mm,叶片背面相对应的部位形成突起的白色庖斑疤斑表皮破裂后散出白色粉状物(病原菌抱子囊) 疤斑可相互汇合,形成大的斑块田间发病严重时,向日葵叶柄和花盘上也会发病 5.2病原形态向日葵白锈病菌菌丝无色,分支,产生短的抱囊梗,(31.484m~ 59.19m)×(6.074m16.12m). 袍子囊成串产生袍子囊球形、卵形或多角形,单胞,无色,(16.324m21.184m)×15.124m 20.54 4m) 卵袍子褐色至黑色,壁有刺突,生长在寄主组织(向日葵种子,叶片、叶柄,花盘等)中,大小 46.57 66.82 ×(45.49 65.77 7Am) 抱子囊在水滴中30min就可萌发,产生游动袍子 Am 丛m 从m" 游动他子直径唇wm一12m,具1条鞭毛经染色后,带幽向日劳种子的果皮和种皮中可观黎到蓝色菌丝体,抱子囊和抱囊梗,以及褐色卵袍子向日葵白锈病菌的形态图参见附录C 5.3巢式CR检测结果在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下,通用引物NL1/NL4首轮PCR扩增片段大小为700bp,特异性引物ATHP3/ATHP4第二轮PCR扩增片段大小为370bp 5.4实时荧光PCR检测结果当空白对照的C值>40,供试菌株的C值<36,则检测结果为阳性,否则为阴性 6 结果判定田间向日葵为害症状同5.1,向日葵病组织向日葵病叶和种子)中病原菌的形态特征与5.2的描述 -致,可判定为向日葵白锈病菌在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下,巢式PCR扩增获得片段大小为370bp的条带,可判定为向日葵白锈病菌在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下,用实时荧光PCR法检测结果为 -Ct值小于或等于36,则判定为向日葵白锈病菌;
GB/T31808一2015 -Ct值大于或等于40,则判定为非向日葵白锈病菌; C值在36~40之间,应重做实时荧光PCR,再次扩增后,如C值小于或等于36或者C值大于或等于40,判定同上;如果检测Ct值仍在3640之间,则应进行形态学方法鉴定样品与原始数据保存样品保存存查样品应视样品的状态采用相应的保存方式妥善保存如样品中发现向日葵白锈病菌,该样品应保存半年以上,以备复验,如涉及贸易纠纷则应保存到纠纷解决完毕,保存期满后应经灭菌处理 7.2原始数据保存样品检测结束后,其原始记录单和检验报告或证书应归档,妥善保管.以备复验,谈判和仲裁 7.3菌种保存用干净剪刀将具典型症状的向日葵白锈病叶剪成1cmX1cm左有的小片,置于菌种保藏管中,经脱水干燥后封好管盖,置于4C黑暗条件下保存至少12个月,以备复验、谈判和仲裁
GB/I31808一2015 附录A 资料性附录向日葵白锈病菌相关信息 A.1背景资料 A.1.1病菌基本信息中文名:向日葵白锈病菌英文名;sunflowerwhiterust 学名:Abugotragopogonis(Pers.s.F.Gray 异名:AbugotragopogiPers.Sehroet,CystopustragopogonisPers.J.Sechrit 分类地位:藻菌界Chromista、卵菌门Oomycota、卵菌纲Oomycetes、霜霉目 Peronsporsles),白锈菌科(AIbuginaceae),白锈菌属(Abugo) A.1.2方法原理根据向日葵白锈病菌形态学特征、为害症状和目标片段的序列特征作为鉴定依据 A.2地理分布世界分布:法国,德国,匈牙利,罗马尼亚,前苏联、津巴布韦,肯尼亚、南非,美国、阿根廷,乌拉,玻利维亚、澳大利亚、印度分布:新疆伊犁 A.3寄主范围向日葵(Helianthusannu4sI. A.4传播途径向日葵白锈病菌主要随种子及种子间夹杂的病残体进行远距离传播扩散,田间通过气流、雨水和澈溉水作近距离传播
GB/T31808一2015 附录B 规范性附录向日葵白锈病菌CR检测方法 B.1DNA提取方法将向日葵种子或病变组织冷冻加液氮研磨,放人1.5mL离心管中,在离心管加人300AL500L cTAB缓冲液(含0.1g蛋白酶K)混匀,65C水浴1h;13000片离心5min,保留上清液;加500A Tis饱和酌;三叙甲棕异戊醉(体积比为25124:1)混匀,1300兵离心5min,保留上请液;再加 500L三氯甲炕:异戊醇(体积比为24:1)混匀,13000离心5min,保留上清液;加人1mL异丙醇混匀，一70C下放置1h,或一20C过夜;13000离心30min,可见DNA沉淀;70%乙醉洗DNA沉淀,室温干燥;用30aLTris-EDTA缓冲液溶解病原菌DNA,待用也可采用市售试剂盒法提取样品DNA B.2巢式CR检测用真菌通用引物NL1/NL4对供试材料进行首轮CR扩增,通用引物序列如下 NL1:5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3';NL4:5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG3 25LPR反应体系10×缓冲液2.5pL.25mmoal/几MgCl1.8AL.2.5mmolLdNTP”L. 5U/lTagDNA聚合酶0.2L,10mol/L.上、下游引物各1AL,DNA模板1AL,ddHl.,O15.5AL 反应条件;预变性94C3min;94C1min.52C1nmin.72C1min,共35个循环;72C延伸 0min 将首轮PCR扩增产物稀释500倍后做模板,再用特异性引物ATHP3和ATHP4进行第二轮PCR 扩增引物序列为 ATHP3:5'-CTTGcAGTcTcTGcTcGG3';ATHP4;5'-AcTGAcTTTGAcTccTccT-3' 25L反应体系:10×缓冲液2.5ML,25mmol/LMgCl1.8AL,2.5mmol/L.dNTP2L,5U/L TuqDNA聚合朋02L..l0nmol/L上、下游引物各1pL.,DNA模板3》L,ddaH.o13.5l 设阳性对照为向日葵白锈病菌的DNA，阴性对照为健康向日葵叶片的DNA等,以灭菌去离子水作空白对照，每个样品重复2次反应条件;预变性953min;9530s,56C30s,72C30s,共35个循环;72C延伸7min 取PCR扩增产物5AlL,加人1.5MlL上样缓冲液(0.25%澳酚蓝,40%蔗糖水溶液),混匀,在1× TAE电泳缓冲液、1.5%琼脂糖凝胶中电泳,5V/em,凝胶成像仪分析结果 B.3实时荧光PCR检测实时荧光PCR法检测所用的特异性引物为ATHF和ATHR,引物序列为 ATHF;5'-CTGACTTTGACTcCTcCGTGGC3',ATHR:5'-GAGACCGATAGCGAACAAG3' 探针ATH-X;5'-FAM-TTTcAGCAGTTTcAGGTACTcTTTAAc-TAMRA-3',探针5'端标记为报告荧光染料FAM),3'端标记为淬灭荧光染料TAMRA
GB/I31808一2015 25L反应体系中含样品DNAlL.l0×缓冲液2.5L..25mmol/1.Mg(cCl2L.2.5mmol儿 dNTP2.5L,5Amol/L，Primers各2L,24mol/L探针5l,5U/l，TaqDNA聚合酶0.2AL ddH,07.8Al 反应条件;50c2min;95c10min;然后进人95c10s,60c1nmin,循环40次
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GB/T31808一2015 参考文献 [1]陈卫民,张中义,马俊义,焦子伟.国内新病害新疆向日葵白锈病发生研究[] 云南农业大学学报,2006,21(2):184-187. [2]李征杰,任毓忠,杨栋等伊犁地区向日葵白锈病的初步研究[] 新疆农业科学,2004,41 3)31. [3]刘彬，张祥林，王聊等向日葵白锈病菌巢式PCR检测方法的研究[] 新疆农业科学， 201l，48(5):859-863 [4]夏正汉,付文君等新疆新源县发现油葵白锈病[] 植保技术与推广,2002,6(21):9. [5 ssover20 ofsunfower hreeding AhlelardoJ，lanhd，scotc.Progre incentral years Argentina] FieldCropsResearch，2007，100(1):61-72. [6 SaeedR.KhanParamuralBodies ofAbugo candida[] Arch Mierobiol 1976，109: 271-275

向日葵白锈病菌检疫鉴定方法GB/T31808-2015

向日葵白锈病是由白锈病菌引起的真菌性病害，主要危害向日葵的叶片、茎和花序等部位，导致向日葵的生长发育受阻，严重时会导致向日葵死亡。为了防止向日葵白锈病的发生和传播，需要对向日葵进行检疫鉴定。

GB/T31808-2015标准规定了向日葵白锈病菌检疫鉴定的方法，主要包括样品采集、分离鉴定和结果判定三个步骤。

1. 样品采集

在向日葵生长期间，从可能受到感染的部位取样。样品可以是叶片、茎、花序等，要求患病比例不低于10%。每个样品应该分别进行收集，并且保证每个样品都有足够的数量。

2. 分离鉴定

将样品带回实验室后，用无菌操作的方式将样品分离出来的白锈病菌接种在含有适宜培养基的琼脂平板上，在25-28℃温度下孵育5-7天。经过培养后，观察是否有白锈病菌的生长。

如果观察到有白锈病菌的生长，则需要进一步进行菌株的鉴定。鉴定的方法包括形态学特征、生理生化特性和分子生物学鉴定等。

3. 结果判定

根据GB/T31808-2015标准中规定的方法，对样品进行分离鉴定后，可以得到白锈病菌检测结果。如果样品中检测到了白锈病菌，则认为该样品为阳性；如果样品中未检测到白锈病菌，则认为该样品为阴性。

通过GB/T31808-2015标准中规定的方法，可以准确地对向日葵白锈病进行检测和鉴定，为向日葵生产提供了重要的技术支撑。