动物源性食品中β-受体激动剂残留检测方法液相色谱-质谱/质谱法

动物源性食品中β-受体激动剂残留检测方法液相色谱-质谱/质谱法

国家标准 GB/T21313一2007 动物源性食品中卜受体激动剂残留 检测方法液相色谱-质谱/质谱法 Analysisofpagomistsinfoodsofamimaloriginbyhighperformance liquidchromatographytandemmassspeetrometry 2007-10-29发布 2008-04-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T21313一2007 前 言 本标准的附录A,附录B附录C,附录D,附录E均为资料性附录 本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口 本标准起草单位:北京市疾病预防控制中心、检验检疫科学研究院、疾病预防控制中心营 养与食品安全所 本标准主要起草人:邵兵、李晓娟、吴永宁、彭涛、孟娟、杨奕、代汉慧、国伟 本标准为首次发布
GB/T21313一2007 动物源性食品中B-受体激动剂残留 检测方法液相色谱-质谱/质谱法 范围 本标准规定了仔受体激动剂类兽药残留检测的制样方法和液相色谱-质谱/质谱确证方法 本标准适用于猪肉、猪肝,猪肾等动物源性食品以及猪尿中克伦特罗,沙丁胺醉醇、妥布特罗、特布它 林,非诺特罗,福莫特罗,莱克多巴胺、异丙喘宁等8种8受体激动剂类残留量的高效液相色谱-质谱/质 谱测定 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682一1992,neqIsO3696;1987 方法提要 试样中仔受体激动剂残留经酶解后,再用高氯酸溶液提取,经过滤和离心后，上清液用HLB和 MCx固相萃取柱净化液相色谱/串联质谱仪测定,外标峰面积法定量 制样方法 制样操作过程中应防止样品污染或残留物发生变化 4.1动物肌肉、肝脏、肾脏 从所取全部样品中取出有代表性样品约500g,剔除筋膜,用组织捣碎机充分捣碎均匀,装人洁净容 器中,密封,并标明标记,于一18C以下冷冻存放 4.2猪尿 从所取全部样品中取出有代表性样品约500g,充分混匀,装人洁净容器中,密封,并标明标记,于 一18C以下冷冻存放 试剂和材料 除特殊注明外,本法所用试剂均为色谱纯,水为GB/T6682规定的一级水 5.1甲醇 5.2高氯酸;分析纯 5.3氨水;分析纯(浓度25%一28%). 5.4甲酸(99%,ameisensaeure) 5.5氢氧化纳;分析纯 乙股.分析纯 5.6 5.7 乙酸钠(NaAe4H,O);分析纯 乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH5.2);称取43.0gNa.Ae4H.O和25.2g乙酸,加水溶解并定容到 100ml
GB/T21313一2007 5.90.1%甲酸水溶液 55 105%甲醇氨溶液;量取5mL氨水(53),用甲醇定容至100ml 55 1120%甲醉水溶液 55 120.1nmol/儿高氯酸 .13 5. 0.lmmol/L高氯酸 5 14葡糖醛酸苷肽酶/芳基碱酸酯酶溶液(gglueuronidase/arylsullfatase)(30U/ml). 5.15标准物质:妥布特罗(tulobuterol,CAs:41570-61-0),特布它林(terbutaline,CAs;23031-25-6 沙丁胺醇(salbutamol,CAs:51022-70-9)、非诺特罗(fenoterol,CAs:1944-12-3),福莫特罗(formoterol. e,CAS;97825-25-7、 CAS;73573-87-2),克伦特罗(clenbuterol,CAS37148-27-9),莱克多巴胺(rt ractOpamine, 异丙喘宁(m netaproterenol,CAS,586-06-1) 纯度均大于等于99% 5.16标准溶液 5.16.1标准储备溶液;准确称取克伦特罗、沙丁胶醇,妥布特罗、特布它林、非诺特罗、福莫特罗,莱克 多巴胺、异丙喘宁各0.0100g,分别用甲醇溶解并定容至10ml,浓度为1000mg/L，一18C冰箱中保 存,有效期12个月 标准工作液;根据需要,用甲醇将标准储备溶液(5.16.1)配制为适当浓度的标准工作液 标准 5.16.2 工作液应使用前配制 HLB固相萃取柱(G00mg,GmL)或其他等效柱 5.17 18MCx固相萃取柱(60mg,3mL)或其他等效柱 5 仪器 高效液相色谱-串联质谱仪 6.1 6.2电子天平;感量0.0001g 6 3 电子天平;感量0.0l只 6.4组织匀浆机 旋涡混合器 .5 冷冻离心机(最大转速高于10000r/min) .6 a， 聚丙烯离心管(50mL 反.8酸度计(0.o. 6. 9 氮吹仪 6.10固相萃取仪 .11超声清洗仪(功率5w) 6 提取及净化 提取 准确称取10.0g样品,加人15mLpH5.2的乙酸-乙酸钠缓冲溶液(5.8),1000r/min匀浆1min 再加人日葡糖醛酸苷肽酶/芳基磺酸酯酶溶液100L,于37C士1C振荡酶解过夜 取出冷却后,用高 氯酸调pH值至1.0,超声振荡20min,取出置于80C水浴中加热30min 放人冷冻离心机中,10 10000r/min离心10min 倾出上清液,残渣再用10mL0.1nmol/儿高氯酸溶液提取一次,100001 r/min 离心,合并上清液 用1mol/L氢氧化钠溶液调pH值至4.0,此溶液待过HLB固相萃取柱 7.2净化 7.2.1HLB柱净化 HLB固相萃取柱(5.17),使用前用6ml甲醉,6ml水活化 将7.1提取的溶液以2mL/min~ 3mL/min的速度过柱,弃去滤液,用2mL5%甲醇淋洗,小柱抽干,再用6mL甲醇洗脱 洗脱液用氮
GB/T21313一2007 气吹至近干 用3mL0.1 nol/儿高氯酸溶液溶解残渣,供MCX柱净化用 mm 7.2.2MCx柱净化 MCX柱(5.18),使用前用3ml.5%甲醇氨3mL甲醇,3mL水,3mL.0.1mmol/L高氯酸(pH4.0) 溶液活化 将7.2.1制得的溶液过柱,弃去滤液,依次用1nml甲醇,1mL2%甲醇水溶液淋洗,最后用 7mL5%甲醉氨洗脱,洗脱液用氮气吹近干后,用甲醇-0.1%甲酸水(10十90)定容至1.0mL,旋涡混合 1min,用于HPLC-MS/MS测定 基质加标标准工作曲线的制备 将混合标准工作液(5.16.2)用初始流动相逐级稀释成0.54g/L50.04g/L的标准系列溶液 称 取与试样基质相应的阴性样品10.0g,加人标准系列溶液1.0mL,按照7.1、7.2与试样同时进行提取 和净化 液相色谱-质谱/质谱测定 8.1液相色谱条件 .1.1色谱柱:ACQUITYUPLCTMBEHC柱(100mm×2.1mm,1.7m)或其他等效柱 8 8. 1.2流动相;甲醇-0.1%甲酸水梯度淋洗,参考梯度条件见表B.1 8. .1.3流速:300L/min 4 8.1. 柱温:40C 进样量:10L 8. 2 质谱参考条件 离子化模式;电喷雾电离正离子模式(ESI十);质谱扫描方式;多反应离子监测MRM);其他参考 质谱条件见附录A 定性 1 9. 保留时间 试样中目标化合物色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间一致,变化范围应在士2.5%之 内 各化合物的参考保留时间见表B.2 信噪比 待测化合物的定性离子的重构离子色谱峰的信噪比应大于等于3(s/N>3),定量离子的重构离子 色谱峰的信噪比应大于等于10(s/N>l0) 定量离子、定性离子及子离子丰度比 9 3 每种化合物的质谱定性离子必须出现,至少应包括一个母离子和两个子离子,而且同一检测批次 对同一化合物-样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标谁浴被相比,其允许偏差 不超过表1规定的范围 各化合物的参考质谱图和标准溶液色谱图见附录C、附录D. 表1定性时相对离子丰度的最大允许偏差 >50% >20%一50% >10%20% S10% 相对离子丰度 允许相对偏差 士20% 士25% 士30% 士50% 10 定量 按式(I)计算残留量 cV×1000 X= m1又1000
GB/T21313一2007 式中: -样品中待测组分的含量,单位为微克每千克(4g/kg); -测定液中待测组分的浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL) 定容体积,单位为毫升(mL). 样品称样量,单位为克(g) 77 注:计算结果需扣除空白值,测定结果用平行测定的算术平均值表示,保留两位有效数字， 方法的检出限和回收率 11 11.1检出限 按能够准确确认的目标化合物浓度来估计各目标化合物在不同样品基质的检出限,样品基质,取样 量、进样量、色谱分离状况电噪声水平以及仪器灵敏度均可能对样品检出限造成影响,因此噪声水平应 从实际样品谱图中获取 当某目标化合物的结果报告未检出时应同时报告样品检出限 克伦特罗、沙丁胺醇,妥布特罗、特布它林、非诺特罗、福莫特罗,莱克多巴胺、异丙喘宁在动物组织 和猪尿中的检出限为0.10g/kg,定量限为0.30g/kg 11.2回收率 回收率试验采用三个添加浓度(0.14g/kg,0.54g/kg,2.04g/kg)计算方法的加标回收率 猪肉中 8种受体激动剂的加标回收率在86.3%~118.2%之间,相对标准偏差(RSD)在4.6%~18.4%之间;猪 肝中8种}受体激动剂的加标回收率在85.3%~119.7%之间,RSD在2.9%~14.7%之间;猪肾中8种 产受体激动剂的加标同收率在7.5%一6.8%之间,RsD 在&.0%一15.5%之间指屎中 8种B受体激动剂的加标回收率在78.5%l13.5%之间,RSD在32.2%~16.9%之间 具体见附录E 质量控制和质量保证 1 精密度和准确度试验 在分析实际试样前,实验室应达到可接受的精密度和准确度水平 通过对加标试样的分析,验证分 析方法的可靠性 取不少于3份基质与实际试样相似的空白样品,分别加人标准溶液 将制备好的加标试样按上述 方法进行分析,各目标化合物的回收率应在75%125%范围内,RSD小于20% 在进行实际试样分析之前,应达到上述标准 当试样的提取,净化方法进行了修改以及更换分析操 作人员后,应重复上述试验并直至达到上述标准 实验室每G个月应进行上述试验,并直至达到上述 标准 如果可以获得与试样具有相似基质的标准参考物,则可以用标准参考物代替加标试样进行精密度 准确度试验 12.2方法空自 每个批次最多15个样品,需做一次方法空白试验 12.3质控样品 每个批次最多15个样品,需带一个质控样品 质控样品可以是标准参考物,也可以是已知浓度的 加标样品 根据加标浓度，目标化合物的测定值应在标准值的75%125%范围之内 12.4保留时间窗口 每100次进行窗口确定标准溶液的分析,确定保留时间窗口的正确 当更换色谱柱或改变色谱参 数后均应使用窗口确定标准溶液对保留时间窗口进行校准 12.5质谱仪的质量数校正 每周用校正液进行一次质谱仪的质量校正,确保监测离子的质量数不发生改变
GB/T21313一2007 12.6玻璃仪器的准备 所有需重复使用的玻璃仪器应在使用后尽可能快地认真清洗,清洗过程如下 用该仪器接触过的最后一种溶剂冲洗; 依次用己炕和丙酮冲洗; 用含碱性洗涤剂的热水清洗 依次用热水和去离子水冲洗 依次用丙酮己婉和二氯甲烧冲洗 使用加人含有碱性洗涤剂的热水的超声波清洗设备对清洗有很好的效果 如果使用刷子需特别注 意不要划损玻璃仪器的表面
GB/T21313一2007 附 录A 资料性附录 参考质谱条件 参考质谱条件 毛细管电压;3.3kV; a 锥孔电压:60V; b) 射频透镜1电压;40V; d)射频透镜2电压;0.5V 源温度:100C e 脱溶剂气温度;350C; 脱溶剂气流量;580L/h:; g 电子倍增电压:650V 喷撞室压力:0.28Pa 其他质谱参数见表A.1 表A.18种B-受体激动剂主要参考质谱参数 碰撞能量/eV 化 尽 物 子 子 母离 离 12 193.7" 异丙喘宁 21l.8 16 151.7 151.7” 16 226.0 特布它林 169.8 12 18 47.8" 沙丁胺醉 240.1 221.9 12 18 134.8" 非诺特罗 304.1 107.0 18 163.7" 16 莱克多巴胶 302.1 12 284.2 16 202.9" 277.1 克伦特罗 10 259.0 14 49.0" 福莫特罗 345.1 327.1 18 16 53.8" 妥布特罗 227.9 12 171.8 注:对不同质谱仪器,仪器参数可能存在差异,测定前应将质谱参数优化到最佳 定量离子 o.Ulima叫P质请仅上完成的.此处列出试验用仅器醒号仅为提供 1 所列参考质谱条件是在Mieromass-Quattro 参考,并不涉及商业目的,鼓励标准使用者尝试不同厂家或型号的仪器
GB/T21313一2007 B 附 录 资料性附录) 参考液相色谱条件 表B.1分离8种B-受体激动剂的参考梯度条件 时间/minm 0.1%甲酸水/% 甲醇/% 95 11 40 60 11.1 95 15 95 表B.28种p-受体激动剂的参考保留时间(RT 物 RT/min 异丙喘宁 1.89 特布它林 2.67 沙丁胺醇 2.82 非诺特罗 3,62 莱克多巴胶 55 38 6.03 克伦特罗 福莫特罗 6.29 妥布特罗 6.76
GB/T21313一2007 C 附 录 资料性附录) 8种卜受体激动剂的子离子扫描质谱图 202." 00 258.9 276.9 pA" l263.0 131.9 249.o 28o.6295.1 Hm送 4业豆 a.., " " n而a蹦 T2 220 2o 6o 80 10o 260 图C.1 克伦特罗二级质谱图 304.0 00r 134.8 286.0 151.6 ? 1698 In.了 "代叫" 67？ 349.0 A3盈.9.M.O m/n 叶茹 雷雷湖一动霜 图C.2非诺特罗二级质谱图
GB/T21313一2007 148.9 10o 1209 327.0 40 28 "s胜A" 1349.0 小-胜.A黑 m/z 雷动 60 80 图c.3福莫特罗二级质谱图 151.7 10o 1.8 1247 176.? 2182247 06.7 1347银？" 170.5 8.ls.15,.5 ,2了7 R.0狐AI8工 "" 出需新，H讨面市西 图C.4异丙喘宁二级质谱图
GB/T21313一2007 63.8 100r 284.0 120.8 135.8 106.7 302.0 上堂 ,趴9 336.9348.9 上 A m/a "劲3如 O0 图C.5莱克多巴胺二级质谱图 151.7 100r 2.9 169.7 20.9 "兴验 50 图c.6特布它林二级质谱图 10
GB/T21313一2007 227.9 10o 153.7 17？ Iiue ,简a "k"世 H S13 Ro" " D窗高0端 图c.7妥布特罗二级质谱图 147.7 I0or l67 229 圆a 是 风a”s Goi'ao动 0 图C.8沙丁胺醇二级质谱图 1l
GB/T21313?2007 ?D ??) 8B-弤???? .89 1oO 6.o0 .0 10.0o 4.00 12.0 14.00 ?? 4.00 6.0 8.0 10.00 12. 14.0 ? 2.67 0.0o 4.0 4.00 6.0 8.00 12.O ?? 3.62 .00 6.00 8.00 10.0o 2.00 14.0o ?? 5.36 0 8.oo 10.0 2o 14.w 6.00 ? 6.,29 4.00 6.00 8.00 10.00 12. 14.00 6.,03 4.0 6.00 8.00 10.00 12. 14.0 6.76 ? 4.0o 8.00o a.00 2.0w 14.o 6.00 ?D.18?-弤???? 12
GB/T21313一2007 E 附 录 资料性附录) B-受体激动剂的回收率和RsD 表E.1猪肉中p-受体激动剂的回收率和RSDn=6) 加标水平0.5g/kg 加标水平2.04g/kg 加标水平01E/ke 化合物 RSD/% RSD/% RSD/% 回收率/9% 回收率/% 回收率/% 95.2 99.8 8.8 97.3 10.0 沙丁胶醉 6.7 福莫特罗 86.5 9,9 91.3 9.8 97.1 8.0 6.5 妥布特罗 110.8 6,5 108.2 1l8.2 10.4 克伦特罗 97.7 9,4 110.9 7.2 103.3 8.3 莱克多巴胺 109.2 12.4 112.4 4." 107.3 l1.7 非诺特罗 卫2.5 86.3 914 4.6 96.8 5.8 93.5 12.3 117.2 96.7 特布它林 6.4 18.4 10.1 108.9 105.5 97.5 13.6 异丙喘宁 表 E.2猪肝中B-受体激动剂的回收率和RSDn=6) 加标水平0.1pg/kg 加标水平0.5g/kg 加标水平2.04g/kg 化合物 RSD/% RSD/% RSD/% 回收率/% 回收率/% 回收率/% 沙丁胺醇 97.7 14.7 90.6 3.2 95.8 6.9 福莫特罗 117.0 2.9 102.1 11.4 94.8 6.1 妥布特罗 119.7 3.6 94.3 5.0 94.2 7.1 克伦特罗 92.3 11.5 91. 7. 92.6 9.3 莱克多巴胺 98.8 10.3 91,5 5.8 89.4 4.8 92.3 非诺特罗 99.3 9.4 5.9 95，4 6.4 95.2 14.5 89,7 3,7 88.4 特布它林 4.9 85.3 10.7 5.9 异丙喘宁 90,8 92.7 10.9 表 E.3猪肾中B-受体激动剂的回收率和RSD(n=6) 加标水平0.1pg/kg 加标水平0.5g/kg 加标水平2.08/ke 化合物 RSD/% 回收率/% RSD/% 回收率/% RSD/% 回收率/% 沙丁胺醇 101.3 12.2 109.1 5.2 1l4.6 9.2 96.3 113.3 98.1 福莫特罗 7.5 3.1 5.6 妥布特罗 90.3 10.7 91.9 4.0 93.8 5.3 克伦特罗 91.7 15.5 116.8 3.0 89.8 6.1 莱克多巴胺 81.3 ll.3 93.1 4.8 96.3 5.6 非诺特罗 101.0 10.9 113.0 5.2 102.4 5.9 特布它林 108.2 5.1 77.5 10.2 83,9 4.2 异丙喘宁 89.0 8,4 99.1 3.0 91.1 4.2 13
GB/T21313一2007 表E.4猪尿中p-受体激动剂的回收率和RsD(n=6) 加标水平0.1g/kg 加标水平0.5g/kg 加标水平2.08/ke 化合物 回收率/% RSD/% RSD/% 回收率/% RSD/% 回收率/% 沙丁胺醇 109.7 8.8 95.1 2.2 94.8 5.6 福莫特罗 113.3 4.9 96.9 3.2 92.5 6.6 妥布特罗 82.8 ll.3 86.7 3.0 94.5 4.7 克伦特罗 99.8 16.8 97.8 3.8 94.8 8.8 莱克多巴胺 87.9 9.4 93.2 8.7 6.l 78.5 113.5 7.2 92.8 4.6 95.4 非诺特罗 5.3 109.0 8.2 88.o 3.5 97.9 特布它林 异丙喘宁 101.7 16.9 79,2 5.9 91.6 14