GB/T35911-2018
伪狂犬病病毒荧光PCR检测方法
Real-timePCRmethodfordetectionofpseudorabiesvirus
- 中国标准分类号（CCS）B41
- 国际标准分类号（ICS）11.220
- 实施日期2018-09-01
- 文件格式PDF
- 文本页数9页
- 文件大小566.77KB
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伪狂犬病病毒荧光PCR检测方法
国家标准 GB/T35911一2018 伪狂犬病病毒荧光PCR检测方法 Real-timePCRmetholfordeteetionofpseudorabiesvirus 2018-02-06发布 2018-09-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/35911一2018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准由农业部提出
本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/Tc181)归口
本标准起草单位:上海出人境检验检疫局、农业科学院上海兽医研究所、中华 人民共和国深圳出人境检验检疫局、检验检疫科学研究院、湖南圣湘生物科技有限公司
本标准主要起草人:张强、童光志、李健、熊炜赵和平、李树清、王艳、李国新、杨忠苹,花群义、林颖峥、 王巧全、蔡开妹、喻正军、吴绍强、林祥梅
GB/35911一2018 伪狂犬病病毒荧光PCR检测方法 范围 本标准规定了伪狂犬病病毒荧光PCR检测的操作方法
本标准适用于伪狂犬病病毒核酸检测
规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
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GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T25172猪常温精液生产与保存技术规范 缩略语 下列缩略语适用于本文件
荧光PCR荧光聚合酶链式反应(realtimepolymerasechainreaetion C值每个反应管内的荧光信号量达到设定的阔值时所经历的循环数(eyelethreshold) DNA脱氧核糖核酸(deoxyribonueeicacid Ta酶TaqDNA聚合酶(TaDNApolymerase) TE缓冲液Tris-EDTA缓冲液(Tris-EDTAbufer) PRV 伪狂犬病病毒(pseudorabiesvirus) 仪器 4.1荧光PCR检测仪
4.2高速台式冷冻离心机:可控温至4、离心速度可达12000r/min以上 4.3组织研磨器或者研钵
4.4普通冰箱;2C8C 4.5普通冰柜:一20C以下
4.6超低温冰箱.可控温至一70以下 47 微量移液器;0.2l24lL、1Al10L,10l1004L、,20AL一2004L,100l1000L,并 配备与移液器匹配的吸头
4.8高压灭菌锅
5 耗材 5.11.5mL离心管
5.20.2mlPCR薄壁管或八联管
GB/T35911一2018 6 试剂 6.1除非另有说明,在检测中使用的试剂均为分析纯,实验室用水应符合GB/T6682的要求
6.2DNAzol,商品化DNA抽提试剂,于2C一8C保存
6.3无水乙醇，-20C预冷
6.475%乙醇,无水乙醇和双蒸水配制-20笔预冷
6.58mmol/LNaoH溶液,配制见附录A
6.6PBS缓冲液,配制见附录A
6.7Taq酶及10倍Taq酶反应缓冲液;Taq酶浓度为5U/aL,Taq酶反应缓冲液中Mg浓度 为15mmol/1
6.8dNTPs;含dATP、dGTPdCTP,dTTP各10mmol/L,一20C保存,避免反复冻融
6.9引物和TaqMan探针,其序列见附录B. 6.10伪狂犬病病毒阳性对照样品和阴性对照样品:阳性对照使用灭活疫苗或组织培养灭活毒， -20C保存备用;阴性对照可采用健康猪的组织材料.
6.11内参照质粒;带有人P珠蛋白基因的质粒
样品采集和处理 7.1采样工具 7.1.1手术刀,剪刀、锻子,经160C干热灭菌2h
7.1.2 -次性无菌采样拭子
7.1.3组织研磨器或者研钵,经160C干热灭菌2h
7.1.4真空采血管
7.2样品采集 7.2.1血液样品采集;用无菌注射器采集血液,注人含1/104%E:DTA溶液的无菌容器中,充分混匀 编号备用
7.2.2精液样品采集;按照GB/T25172的方法采集和保存精液
7.2.3鼻拭子采集;用棉拭子取受检动物鼻腔分泌物,置于2mlPEBS缓冲液中备用
7.2.4组织样品采集;取大脑海马背侧皮层、中脑、脑桥、三叉神经节、扁桃体、肺脏、淋巴结等组织,置 于无菌离心管内,编号备用
7.2.5细胞培养物:细胞培养物反复冻融三次,第3次解冻后,将细胞培养物置于1.5ml无DNA酶 的灭菌离心管内,编号备用
7.3样品保存和运输 上述采集的样品可立即用于检测
不能立即检测的样品,在2C一8C下保存应不超过24h -20C士5C下应不超过3个月,一70C以下可长期保存
样品运送采用低温保存进行运输,并在规 定温度下的保存期内送达
7.4样品处理 7.4.1血液和精液样品无需进行前处理,直接用于核酸提取
3 7.4.2鼻拭子样品:充分涡旋震荡含有鼻拭子的管子1min min,弃去拭子后2000r/min离心
GB/35911一2018 5 min,取上清后用于后续的核酸提取
7.4.3组织样品;取1g解冻的组织,剪碎,加人2mLPS缓冲液进行研磨,制备组织匀浆,8000r/min离 心5 1,取上清用于后续的核酸提取
min. 7.4.4细胞培养物:4000r/min,4C离心10min,取上清用于后续的核酸提取
荧光PCR操作程序 8.1DNA抽提 8.1.1在核酸提取区操作
DNA抽提使用DNAzol手工提取,也可以使用等效的商品化试剂盒提取
8.1.2取n个灭菌的1.5m离心管，其中n为待检样品数十阳性对照十阴性对照，对每个离心管进 行编号
8.1.3每管先加人800L
DNAzol,再分别加人被检样品、阳性对照,阴性对照各200AL,颠倒10次混 匀4C或室温10000r/min离心10nmin
8.1.4取900ML上清,置新的1.5mL灭菌离心管中,加人500L无水乙醇,混匀,室温放置3min; 4C或室温10000r/min离心5min
8.1.5弃上清,沿管壁缓缓加人0.8mL1mL75%乙醇,颠倒3次6次混匀,4C10000r/min离心 5min
反复洗涤两次后,将离心管倒扣于吸水纸上,自然晾干或用移液器移去残液
8.1.6用30AL8mmol/LNaOH溶液溶解沉淀,DNA在2笔8笔冰箱可保存两个月,-20冰相 可稳定保存两年 8.2荧光PCR检测 8.2.1反应体系的配制 在试剂配制区进行
设实时荧光PCR反应管数为n,为待检样品数十阳性管数十阴性管数,每 个反应的体系见附录C,为了避免移液器取样损失,建议按从十1个反应进行配制
配制反应液在冰盒 中进行
8.2.2反应液的分装 将8.2.1中配制的荧光PCR反应液充分混匀,按照每管39.8L分装于0.2m透明PCR管内,将 PCR管置于96孔板上,按顺序加样并做好标识,转移至核酸提取区
8.2.3加样 在核酸提取区进行
在每个PCR反应管内加人0.2AL的内参照质粒,并分别加人8.1制备的核酸 0LDNA溶液,盖上盖子,500r/min~1000r/min离心30s
转移至检测区
上机检测 8.2.4 荧光通道设置 8.2.4.1 在检测区进行
将8.2.3中离心后的PCR管放人荧光PCR检测仪内,设置探针:5'选择FAM、 HEX和ROX三个荧光通道,3'均选择无(None)荧光
8.2.4.2循环条件设置与检测 第一阶段,预反应50C/2min; 第二阶段,预变性95C/2min;
GB/T35911一2018 第三阶段,变性95C/15s,退火、,延伸,荧光采集60C/30s,40个循环; 第四阶段,冷却25/10s 检测结束后,保存结果,根据收集的荧光曲线和C！值判定结果
o 结果判定 9.1阔值设定 闻值设定原则根据仪器噪声情况进行调整,以闵值线刚好超过正常阴性样品扩增的最高点为准
9.2质量控制 9.2.1PRV阴性对照:FAM通道无报告C值或无典型的S型扩增曲线,HEX通道无报告C值或无 典型的S型扩增曲线,ROX通道C值<36且扩增曲线为典型的S型
9.2.2PRV阳性对照:FAM通道C值<30,HEX通道C值<30,ROX通道C值<36,且3个通道 的扩增曲线均为典型的s型
9.2.3 以上要求需在同一次实验中同时满足,否则,本次实验无效,需重新进行
g.3结果描述及判定 g.3.1被检样本检测结果中FAMM通道c值<38.,HEx通道c'值二38,且扩增曲线均为典型的s曲 线,报告为PRV核酸阳性;38
GB/35911一2018 附 录 A 规范性附录 溶液配制 A.18mmol/LNaoH溶液 称量0.32gNaOH,溶解到1000mL去离子水中,混匀,分装,常温保存
磷酸盐缓冲液(0.01mol/L，PBs,p7.4 用800mL燕馏水溶解8gNaCl,0.2gKCI,1.44gNaHPO和0.24gKH,PO
用HCl调节溶 液的pH至7.4,加水至1L
分装后经121C、,15min高压灭菌后备用
GB/T35911一2018 附 录 B 规范性附录) 引物和探针 引物、探针的名称和序列见表B,1
表B.1引物、探针的名称与序列 名 称 序列 gH-qF 5'-ACGCTCGGCTTCCTCTCC-3 gHqR 5'-GGTAGTCGTCGCTCTCGTG3 5'-FAM-TcG;cG;CATcGTcrG;G;T gHP(探针) rGcAT-BHQ1-3" 5'-GCTGTACGTGCTc(GTGAT-3 gE-qF 5'-TCAGCTcCCTTGATGACCGTGA-3'" gEqR gE-P(探针 5'-HEx-CACAAcGGcCAcGTcGCCACcTGBHQ1-3 ICF 5'-AAGTGCTCGGTGCCTTTAGTG3' 1CR -GTCCCATAGACTCACCCTGAAGT-3" [C-P(探针) 5'-ROX-CCTGGCTCACCTG;GACAACCTCAAGBHQ2-3 注:引物和探针可由生物公司合成,用TE溶液溶解并稀释至100Mmol/储存浓度，一20保存备用,保存期为 1年;根据需要配制成10Mmol/儿工作液，-20C保存供检测使用,如经常使用反复冻融,有效期为3个月
GB/35911一2018 录 附 C 规范性附录 荧光CR反应体系 荧光PCR反应体系见表C.1
表c.1荧光rCR反应体系 分 组 1个检测反应的加人量 5L 10×PCRBufer Taq酶(5U/AL) 2AL dNTPs(100mmol/1) l.5Al. 0.25 Mg(1mol/L Al gH-qF(104mol/1 1Al gH-qR(104mol/L) l4L gH-P(104mol/L) 1l gEqF(10mol/L 1AL gE-qR(104mol/L 1Al EI0mal/L》 0.6AL CF0m/L 0.5L cC-R(10 0.5AL mol1) ICP(104mol/I) 0.54 ddH,O 23,.95Al 合计 39.8Al
伪狂犬病病毒荧光PCR检测方法GB/T35911-2018
伪狂犬病病毒是由禽类咳气综合征病毒引起的一种人畜共患传染病，严重影响了家禽产业的发展。因此，建立一种高效、准确的病毒检测方法对于有效控制该疾病具有重要意义。而荧光PCR技术作为一种快速、灵敏的病毒检测方法，被广泛运用于病原体的检测中。
GB/T35911-2018是中国国家标准化管理委员会发布的《伪狂犬病病毒荧光PCR检测方法》标准，规定了伪狂犬病病毒荧光PCR检测的步骤和操作要求。
伪狂犬病病毒荧光PCR检测方法GB/T35911-2018的具体步骤：
1. 样品处理：
将样品进行组织均质化处理，并提取其中的RNA/DNA。其中，RNA提取过程需严格控制，避免RNA的降解和污染。
2. PCR反应：
将反转录后的RNA进行PCR扩增，使用特定引物和荧光探针进行标记。在此过程中，需要对反应液的成分和反应条件进行严格控制，确保PCR反应的准确性和可靠性。
3. 检测结果：
将PCR反应产生的荧光信号进行检测和分析，通过计算荧光值与标准曲线的关系来确定样品中的病毒含量。同时，还需要对检测结果进行验证，确保结果的准确性和可靠性。
总之，伪狂犬病病毒荧光PCR检测方法GB/T35911-2018是一种高效、准确的检测方法。通过严格遵守该标准所规定的步骤和操作要求，可以确保检测的准确性和可靠性，为伪狂犬病的防控提供有力支持。
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