国家标准 GB/T40251一2021 牡蛎单袍子虫病诊断规程原位杂交法 CodeofdiagnsistorMsxdisesefysters一lnsituhybridizaton m1eth0d 2021-05-21发布 2021-12-01实施国家市场监督管理总局发布国家标涯花管理委员会国家标准
GB/40251一2021 前言本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草请注意本文件的某些内容可能涉及专利本文件的发布机构不承担识别专利的责任本文件由农业农村部提出本文件由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归口本文件起草单位:水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推广总站本文件主要起草人:白昌明、杨冰、王崇明、黄、李清、万晓媛、辛鲁生、李晨、余卫忠
GB/40251一2021 牡蛎单抱子虫病诊断规程原位杂交法范围本文件规定了牡蛎单袍子虫病诊断规程中病原定位方法的要求,针对主要病原尼氏单抱子虫 i Haplosporidiwmnelsonn ),给出了原位杂交检测法所需试剂或材料、仪器设备、样品、试验步骤和结果判定本文件适用于尼氏单袍子虫在牡蛎中感染程度的评估和确诊;其他贝类也可参照执行规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 sC/T7205.1-2007牡蛎包纳米虫病诊断规程第1部分;组织印片的细胞学诊断法术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义缩略语下列缩略语适用于本文件 AP;碱性磷酸酶(alkalinephosphatase) BCIP;5-澳-4-氧-3-咧噪磷酸-甲苯胺盐(5-bromo-4-ehloro-3-indolylphosphateptoluidinesalt DAFA;戴维森氏乙醇-福尔马林-乙酸固定液davidson'salcohol-formaln-aceticacidfixative' DG;地高辛(digoxigenin) EDTA-Na 2H.O;二水合乙二胺四乙酸二钠Ethylenediaminetetraaceticaced，disodiumd hydrate MgClg6H,O;六水合氯化镁(magnesiumchloridehexahydrate) NaCl:氧化钠(sodiumchloride' Na,HPO12H.O;十二水合磷酸氢二钠(sodiumphosphatedibasicdodecahydrate) Na,CH.,O;2H,O;二水合柠檬酸三钠(sodiumcitratedihydratey tetrazoliumcehloride NBT氯化硝基四氮陛蓝(4\Nitrobhluer KHPO;磷酸二氢钾(potassiumphosphatemonobasie chloride KCI氯化钾(potassium PEBS;磷酸盐缓冲液(phosphatebuffersalinebuffer) ssC;枸橡酸钠缓冲液(salinesodiumcitratebuffe er Tris;三羚甲基氨基甲烧(Tris[hydroxymmethyl]aminomethane)
GB/T40251?202 TritonX-100;?(Polyethyleneglycoltert-octylphenylether) 5 ? 5.1?,?н?????????? 5.2NaCI 5.3Na,CH.O;2HO. 5.4KC 5.5NagHPO12H,O 5.6KHPO 5.7Tris 5.8TritonX-100. 5.9MgCI6H.O 5.10 EDTA-Na2H.O 5.1 NBT 5.12 BCIP 5.13?K 5.14(?25000 5.15?(?30000~70000). 5.16? 5.17?Y 5.18???? 5.19400 5.20??36o 5.21???MSx1347,:5-ATGTGT-TGG-rGA-CGcTAA-CcG3',??DG ??????л 5.22?;????,?λ????? 5.23?:?δ???,?λ????? 5.24?(?52C54C);? 5.25 5.26?(Denhardt's). 5.27?DNA 5.28?? 5.29??塣 5.30? 5.31?? 5.32??DIG(APDG,0.75U/AL,4C):? 5.33? 5.34;??á 5.35?? 5.3695%? 5.37?(37% 5.38
GB/40251一2021 5.39过滤海水;经纱网(>200目)过滤的海水 5.40DAFA固定液;按附录A的A.1配制 5.4180%乙醇:按A.2配制 5.4270%乙醇;按A.3配制 5.4350%乙醇;按A.4配制 5.445004g/ml多聚赖氨酸;按A.5配制 5.452×SsC;按A.7配制 5.461xSsC,按A.8配制 5.470.5×SsC;按A.9配制 5.48PBS;按A.10配制 5.49i0o4g/mL蛋白酶K;按A.12配制 5.50 0.4%甲醛;按A.13配制 5.51杂交缓冲液:按A.l4配制 5.52缓冲液I;按A.16配制 5.53缓冲液Il;按A.17配制 5.54缓冲液;按A.19配制 5.55缓冲液N;按A.21配制 5.56显色液;按A.23配制 5.570.5%伸斯麦棕Y(ismarkbrownY');按A.24配制仪器设备 6.1石蜡切片机满足4Mmm~7m厚度的石蜡连续切片要求 6.2显微镜;配备高倍镜(40×)和油镜(I00×). 6.3微量移液器;量程0.5AL10AL,200AL1000L 6.4普通冰箱 6.5切片保湿孵育箱 6.6展片水浴锅 6.7 烘片机样品 7.1采样对象牡蛎、扇贝和蛤等易感双壳贝类 7.2采样数量、方法和保存运输采样数量,方法和保存运输应符合sc/T7205.12007附录B的要求海水温度高于10C,且盐度高于15%时为采样的最佳时期 7.3样品的采集稚贝附着后2mm)和幼贝(2mm一30mm)取内脏团;成贝(>30mm)取胃、肠道、闭壳肌和外套膜
GB/T40251一202 8 试验步骤 8.1组织切片制备 8.1.1脱水组织块依次浸人盛有不同浓度乙醇溶液的烧杯中;流程如下:70%乙醇(1h45n 一80%乙醇 min 1h45min)--80%乙醉(1h45” -一95%乙醉(45mim)-95%乙醉(45min)无水乙醉(45 min)- min 无水乙醇(45 min 8.1.2透明脱水后的组织块依次浸人盛有无水乙醇:二甲苯(1:1)混合液和二甲苯溶液的烧杯中,流程如下无水乙醇;二甲苯(1:1)(25min)-二甲苯(20min)-二甲苯(20min). 8.1.3浸蜡恒温箱温度调节至高于石蜡熔点,流程如下;透明后的组织块依次浸人两个盛有融化石蜡的烧杯中各801 min 8.1.4包埋将恒温箱温度调节至高于石蜡熔点进行熔蜡,将熔蜡倒人包埋盒与包埋模具,也可用折叠纸盒;用预温的锻子迅速夹取组织块,切面朝下平放在模具底部;轻轻提起模具,置于冰上使其冷却凝固 8.1.5切片 mm3mm的用蜡铲或刀片将包埋块四周修平,使上下两面修成平行面,保留组织周围附着宽2 石蜡用石蜡切片机切片,厚度5m 对每个石蜡包埋块至少切取两张不连续的切片 8.1.6展片将切片平放于展片水浴锅水面上,待伸展平整后,用涂有多聚赖氨酸的载玻片捞出;置于烘片机上或烘箱内,45C烘片2h 8.2原位杂交 8.2.1组织切片(包括阴性对照和阳性对照)依次通过二甲苯(2次,5min/次)、无水乙醉(2次,l0min/ 次),95%乙醇(2次,l0、/次),80%乙醇(2次,10s/次),50%乙醇(1次,10s),然后用双蒸水冲洗2次每次3min) 8.2.2切片平放在切片保湿孵育箱中,吸取500AL1004g/ml蛋白酶K溶液,加到每张组织切片上， 37C孵育15min. 8.2.3把组织切片上的蛋白酶K溶液吸净,然后将其浸人预冷到4C的0.4%甲醛溶液中5 min 8.2.4室温下,用2×ssC浸洗组织切片5min 8.2.5把组织切片平放在切片保湿孵育箱中,添加500ML杂交缓冲液至每张组织切片,42C孵育 60min 8.2.6添加500"L.含2ng/LDIG标记的寡聚核苷酸探针杂交混合液至每张组织切片,置于90C 95C平板烘片机上保温10min 8.2.7将组织切片置于平整的冰面上淬冷1min.
GB/T40251一2021 8.2.8在切片保湿孵育箱内42C下孵育16h~18h 8.2.9依次用缓冲液2×SsC(5min,室温,2×SsC(5min,室温、1×SsC5min,室温)、1×sSC 5 nmin,室温),0.5×SsC(10min,42C),0.5×SsC(10min, ,42C)浸洗组织切片,然后将组织切片放人缓冲液I(1min一2min,室温 8.2.10加500L缓冲液I封闭组织切片,37C温浴301 min 8.2.11用缓冲液I将AP抗DG稀释至0.75U/pL(1AlL.0.75U/ALAP抗DIG加到1mL缓冲液I 中),添加250儿至每张组织切片,在湿盒中37C温浴3h 8.2.12 用缓冲液I(2次,5min/次,室温、缓冲液川2次,5min/次,室温)浸洗组织切片 8.2.13吸500AL显色液于每张组织切片上,在暗处于室温放置1h3h,随时观察显色情况,当阳性对照有明显显色或阴性对照开始普遍出现非特异性显色,立即终止显色 8.2.14把组织切片置于缓冲液N中15min终止反应 8.2.15组织切片依次在双蒸水(1次,10s),0.5%俾斯麦棕Y(1次,lmin),95%乙醉(3次,10s/次无水乙醉(a次,10s/饮)二甲苯(4次,10<次)中浸洗空气自然干燥后,滴加2滴中性树胶,封片 8.2.16 显微镜下(400倍),寻找着色明显的蓝黑色杂交信号,并拍照 8.2.17 结果判定 9.1检测结果成立条件阳性对照样品组织病灶部位观察到明显的蓝黑色杂交信号,阴性对照样品组织中未观察到任何的蓝黑色杂交信号,实验有效 9.2检测结果判定检测样品组织中观察到蓝黑色杂交信号(参见附录B),则原位杂交检测结果为阳性,判定为尼氏单袍子虫感染;待测样品组织中未观察到蓝黑色杂交信号,则原位杂交检测结果为阴性牡蛎单袍子虫病及其主要病原简介参见附录C
GB/T40251?2021 ? A 淶 ?? A.1DAFA?? 95%? 330ml ?(37%) 220ml 15ml ?? 335ml ,?档 A.280%? 800mL 95%? 950mL ? ,档 A.370%? 95% 700ml ? 950mL ,档 A.450%? 500 95%? ml 950mL ? ,档 A.5500Hg/ml (?25000 5mg 10ml ? ,4C档 A.620xSsc NaCI 175.32g Na.,C,H,O;2H,o 88.23g ??? 1000mL pH 7.0 ?,档 A.72xSsC 20SsC 100mL 900mL
GB/40251一2021 A.81xSScC 20×SSC 50ml 水 950ml A.90.5×Ssc 20sScC 50mL 1950mL 水 A.10PBS KC 0.2g NaClI 8g NaHPO12H,O 2.9g KH,PO. 0.2g l000mL 加水定容至 A.1110mg/ml蛋白酶K 蛋白酶K 100mg 加水定容至 10ml 分装于无菌离心管中(0.25mL/管),一20C下保存 A.12100Hg/mL蛋白酶K 10mg/ml蛋白酶K 0.25mlL PBs 24.75ml 用前临时配制,混匀,4C存放 A.130.4%甲醛甲醛(37% 5.4mL 水 500ml 倒掉前可重复使用4次,用前预冷 A.14杂交缓冲液 20×SSC 10mL 25mL 100%甲酰胶 20×丹哈特液(Denhardt's 2.5mL 0mg/ml鲑精DNA 2.5mL 25%硫酸葡聚糖 10mL 混匀,4C贮存 A.1510×缓冲液I Tris 121.1g NaCl 87.7g 加水溶解至 800mL 7.5 用浓HCl调节pH至
GB/T40251?2021 1000mL ? ?,4C档 A.16?I 10?1 100mL 900ml. ,0.45m??,4C档 A.17?I TritonX-10o 0.3g 2m ?? 00mL ?I 80C???,?ζ,???4C2? C 60 A.1810? Tris 121.1g NaCI 58.4 g ?? 800mL ?HCIpH 9.5 MgCl6H.O 101.6g 1000mL ? ,0.454m??,4C,? A.19? 100mL 10?I 900mL ? ,0.454m??4C,? A.2010?M Tris 12.1 g EDTA-Na2H.O 3.7 g ??, 1000mL HclpH8.0,?4C档 A.21?IV 10?IV 100ml ? 900ml ,0.454m??4C档 A.2210%? ?(?300o0?7000) 10 g ?? 100ml ?,?10mL/,-20C档
GB/40251?2021 A.23?? 90ml ? 仩 24mg 10%? 10mL 4C ??1ml?м: NBT 4.5L BCIP 3.5L A.240.5%?Y 2.5 ?Y g ? 500ml ??,?档 A.25NB? NBT 100 mmg ? 0.931ml ? 0.402nml ??-20C档 A.26BCIP? BCIP 100mg ? 2m ???20C档 A.2720? ??? 0.4g 400 0,4g 0.4 ??360 g 100mL ??? 0,45Am,5mL/???20C档 A.2825%? 25g ? 100ml ? ??????-20C档 A.2910mg/mL?DA 250 ?DNA mg 25mL ? ?DNAμ?,ò????6??Ρ 100C??м10nmin,??д,??С?,?20C档?? 00C??м5min,?
GB/T40251一2021 录附 B 资料性尼氏单抱子虫原位杂交检测结果示例原位杂交法示例见图B.1 20m 2012Elseevierlnc. 说明蓝黑颗粒为杂交信号箭头所示) 图B.1长牡蛎(Crassostreagigas)感染尼氏单袍子虫原位杂交检测结果 0
GB/40251一2021 录附 C 资料性) 牡蛎单袍子虫病及其病原简介牡蛎单袍子虫病是由尼氏单抱子虫(Haplosoridiumnelsoni)感染牡蛎等双壳贝类血细胞、结缔组织和消化道上皮,引起粑组织坏死和个体死亡的疫病该病1957年发生于美国的切萨皮克湾和特拉华湾的美洲牡蛎(Crasosreairginica)中由于最初认为该疫病与一种未知的球形多核体寄生虫有关,因此又被称作MSx(MultinucleateSphereX)病牡蛎单抱子虫病的主要宿主除美洲牡蛎外,还有长牡蛎(Crassostreagigas)和海湾扇贝(Argopecteniradians),几乎易感宿主所有组织器官的上皮和结缔组织均可被尼氏单抱子虫感染,抱子形成阶段仅在消化道上皮中被观察到尼氏单袍子虫在全球的分布比较广泛,如美国的佛罗里达州北部,马萨诸塞州和缅因州法国、日本和韩国等 1993年,曾在我国山东和辽宁养殖海湾扇贝中发现单抱子虫未定种(Haplosoridium sp.) 近年来,利用分子生物学方法,自我国北方海区养殖长牡蛎和海湾扇贝中检测到尼氏单弛子虫DNA 牡蛎单抱子虫病在北半球主要发生在5月中旬到10月底的夏季高温季节,死亡高峰集中在8月到 9月,死亡率可高达90% 高盐环境下患牡蛎单抱子虫病的牡蛎死亡率明显增高

牡蛎单孢子虫病诊断规程原位杂交法GB/T40251-2021

牡蛎是我国重要的经济水产品之一，但近年来，牡蛎单孢子虫病的发病率却不断上升，给养殖业带来了极大的损失。因此，建立一套科学、准确、可靠的牡蛎单孢子虫病诊断规程显得尤为重要。

诊断规程及原位杂交法简介

GB/T40251-2021《牡蛎单孢子虫病诊断规程》的制定，旨在提高牡蛎单孢子虫病的诊断准确率和检测效率。其中，原位杂交法作为一种新型的分子生物学技术，被广泛应用于牡蛎单孢子虫病的诊断中。

原位杂交法（in situ hybridization）是一种基于互补配对的分子生物学技术，其基本原理是将标记有特定探针的核酸序列与待检测样品中的互补序列进行杂交，并通过特殊的检测手段来确认目标序列的存在和位置。

优势

相比传统的诊断方法，原位杂交法具有以下优势：

高度特异性——利用互补配对的原理，能够精确地识别目标序列；
高灵敏度——使用放射性或非放射性标记技术，可以检测到低至单个细胞水平的信号；
直接观察——无需提取DNA或RNA，可在组织和细胞水平上直接观察目标序列的分布情况；
定量分析——结合数字图像处理技术，能够实现定量分析。

注意事项

在实际应用中，需要注意以下问题：

样品处理——为了获得准确的结果，需要选择适当的样品处理方法，避免对目标序列的损伤；
探针设计——探针序列的选择和设计直接影响结果的准确性，需要根据具体的需求进行优化；
信号检测——信号的检测过程需要严格控制实验条件，以避免干扰信号的产生。

结论

原位杂交法作为一种新型的分子生物学技术，在牡蛎单孢子虫病的诊断中具有广泛的应用前景。在实际应用中，需要注意样品处理、探针设计和信号检测等问题，同时，还需要进一步完善和优化该技术的相关方案，以提高其准确性和可靠性。相信在不久的将来，原位杂交法将会成为牡蛎单孢子虫病诊断中不可或缺的重要手段。