猪肾和肌肉组织中乙酰丙嗪、氯丙嗪、氟哌啶醇、丙酰二甲氨基丙吩噻嗪、甲苯噻嗪、阿扎哌隆、阿扎哌醇、咔唑心安残留量的测定液相色谱-串联质谱法

猪肾和肌肉组织中乙酰丙嗪、氯丙嗪、氟哌啶醇、丙酰二甲氨基丙吩噻嗪、甲苯噻嗪、阿扎哌隆、阿扎哌醇、咔唑心安残留量的测定液相色谱-串联质谱法

国家标准 GB/T20763一2006 猪肾和肌肉组织中乙酰丙嗦、氯丙嗪、 氟皈醇、丙酰二甲氨基丙吩嚷凑、 甲苯嚷凑、阿扎隆、阿扎醇、 咔陛心安残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Methodfordeterminationofaeetopromaizine,chlorpromazin,haloperidol propionylpromazine,xylazine,azaperone,azaperolandcarazololresidues nporeinekidneyandmuseletissues- LC-MS-MSmethodl 2007-03-01实施 2006-12-31发布 国家质量监督检验检疫总局 发布 中 国国家标准化管委员会国家标准
GB/T20763一2006 前 言 本标准的附录A和附录B为资料性附录 本标准由秦皇岛出人境检验检疫局提出 本标准由质量监督检验检疫总局归口 本标准起草单位:秦皇岛出人境检验检疫局、辽宁出人境检验检 疫局 本标准主要起草人;庞国芳,宋文斌,董振霖、李一尘,李军、赵守成、贾新 本标准系首次发布的国家标准
GB/T20763一2006 猪肾和肌肉组织中乙酰丙秦、氯丙嗦 氟派吭醇、丙酰二甲氨基丙吩嚏嗦 甲苯曝味、阿扎噪隆、阿扎醇 咔陛心安残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 范围 本标准规定了猪肾和肌肉组织中乙酰丙嗓、氯丙嗓、氟噪晓醇、丙酷二甲氨基丙盼嚷嗓、甲苯嚷嗦、 阿扎哌隆及其代谢物阿扎哌醇和阻断剂咔陛心安残留量的液相色谱-串联质谱测定方法 本标准适用于猪肾和肌肉组织中乙酷内嗓,氧丙嗓,氟眼晓醉、两酷二甲氨基丙盼嚓嗓、甲苯嚓嗓 阿扎喉隆、,阿扎哌醉、咔呸心安残留量的测定 本标准的方法检出限;猪肾和肌肉组织中乙酰丙嗓、氯丙嗦、,丙酷二甲氨基丙盼嚷嗦、咔哗心安均为 0.54g/kg,甲苯嚷嗦为0.25ug/kg,阿扎哌隆为0.24g/kg,阿扎哌醇为0.154g/kg,氟哌醇为 0.1 lp8/k以 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注明日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6379.1测定方法与结果的准确度正确度与精密度第1部分:总则与定义 GB/T6379.12004,ISO5725-l:1994,IDT GB/T6379.2测定方法与结果的准确度(正确度与精密度第2部分;确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法(GB/T6379.22004.ISO5725-2;1994,IDT GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682一1992 2,neqIsO3696:1987) 原理 试样中残留的六种镇定剂及其代谢产物在碱性条件下用特丁基甲酥提取,并通过向提取液中加人 磷酸盐缓冲液(pH=3),使镇定剂被提取到缓冲溶液中,并用特丁基甲净化缓冲溶液,改变缓冲溶液 为碱性,将镇定剂反提取到特丁基甲艇中,浓缩,定容 供液相色谱-串联质谱仪测定,外标法定量 试剂和材料 除另有说明外,所用试剂均为分析纯,水为GB/6682规定的一级水 乙晴色谱纯 4.2甲醇;色谱纯 4.3无水乙醇;色谱纯 4.4盐酸:优级纯
GB/T20763一2006 4.5特丁基甲酥 4.6氢氧化钠 4了氢氧化的辫液;5molL 称取.50.0尽氢氧化纳(.6)用水溶解,定容到250mnL. 4.8磷酸二氢钾 磷酸二氢钾溶液:lmol/LpH=3,称取68.045只磷酸二氢钾(4.8)用水溶解,用盐酸(4.4)将溶 液的pH值调至3.0,定容到500ml 4.10甲酸 4.11甲酸.色谱纯 4.12甲酸铵缓冲液;0.1lmol/儿L,pH=4,称取6.306g甲酸铵(4.10)用水溶解,用甲酸(4.11)将pH值 调到4.0,定容至1000mL 4 13甲酸铵缓冲液:0.01mol/L,pH=4,取甲酸铵缓冲液(4.12)100mL用水稀释定容到1000mL 4.14流动相A:0.01 1nmadl几甲酸饺缓冲液,H=(4.1),通过02pm过逃器过谜 4.15流动相B;乙晴(4.1)通过0.2um过滤器过滤 4 16流动相c;甲醉(4.2)通过0.24m过滤器过滤 4.17混合流动相:将70mL流动相A15mL流动相B以及15nmL流动相C混合 4.18六种镇定剂及其代谢物和阻断剂标准物质 乙酰丙嗦,纯度99% 18.2阿扎哌隆,纯度99% 18.3咔陛心安,纯度:99% 18.4氯丙嗦盐酸,纯度:99% 18.5氟噪醇,纯度>99% 18.6丙酰二甲氨基丙盼嚷嗦 盐酸,纯度;98% 44. 18.7甲苯嚓嗓盐酸,纯度:99% 18.8阿扎眼醉,浓度10.0g/mL(甲醉》. 19六种镇定剂及其代谢物和P阻断剂标准储备溶液 4.19.1乙酰丙嗓,阿扎哌隆、咔陛心安,氯丙嗓,氟听醇,丙酰二甲氨基丙吩嚷嗓、甲苯嚷糜标准储备 溶液;0.10mg/nmL 称取适量的上述标准物质(4.18.1一4.18.7),分别用无水乙醇(4.3),配成 0.10mg/mL的标准储备液 储备液避光在2C4C条件下贮存 每年配制一次 4.19.2阿扎哌醇标准储备溶液;1.0g/mL 准确移取1.0nm阿扎哌醇标准液(4.18.8)于10mL 容量瓶中,用无水乙醉(4.3)定容至刻度,混匀,配成1.04g/mL的标准储备液 储备液避光在2C~ 4C条件下贮存 每年配制一次 六种镇定剂及其代谢物和各阻断剂混合标准储备溶液 4.20 吸取适量的标准储备溶液(4.19.1和4.19.2),用乙晴配制成混合标准储备溶液 在2C一4C条 件下贮存 4.21六种镇定剂及其代谢物和阻断剂混合标准工作溶液 根据每种镇定剂及其代谢物的灵敏度和仪器线性范围用空白样品提取液配成不同浓度(ng/mL)的 混合标准工作溶液 在2C一4条件下避光贮存 注，称取标准物的质量是按纯度和含盐量修正过的质量
GB/T20763一2006 仪器 5.1液相色谱-串联四极杆质谱仪;配有电喷雾的离子源 5.2电子天平;感量0.1mg和0.1g 5.3离心机:最大转速为10000r/min. 5.4离心管;锥形底玻璃离心管,15mL和10mL具塞;锥形底聚丙烯离心管,50mL,具螺旋盖 5.5过滤器;聚四氟乙烯膜过滤器:0.2am×13mm; 尼龙膜过滤器:0.2m×47mm 5.6液体分配器:1mL~10mL和5mL一50mL 5.7微量移吸器;10l100L和100l1000Al 5.8流动相过滤装置 5.9氮气浓缩仪 5.10高速涡流混合器 5 .11振荡器 5. 12食物调理机 .13一次性移液管 5 5. 14酸度计:测量精度为士0.02u unit 5.15超声波仪 5. .16一次性注射器;lmL 5.17试样瓶;2.0m 试样的制备与保存 6.1试样的制备 猪肾要去除脂肪和其他的非肾脏组织,猪肉要去皮和骨头 将其搅碎拌匀 分出0.5k起作为试 样,将制备好的试样密封,并做上标记 试样保存 6. 3 将试样置于一18C条件下贮存 测定步骤 提取 称取试样200x精确到a.p放人0L聚丙蛤离心管中,加人20L乙睛进行讽流混合,梨 合后加人400L5mol1氢氧化钠溶液,并进行涡流混合30s 在(80士5)C水浴中放置1h 在此期 间,要对每个测定样品进行两次涡流混合 1h后,将样品从水浴中取出并冷却至室温 加人12m特 丁基甲酰,置于振荡器上高速振荡15min,离心15min(转速为4000r/min) 吸出上清液,定量将特定 基甲酵转移到干净的15m的玻璃离心管内,待净化 7.2净化 min,离心10min 在上述15mL离心管中加人1mml/儿确股二复伊洛液(pH=3)3nL,振尚10n (4000r/min) 将特丁基甲酥层吸出弃去 在磷酸盐溶液中加人2mL特丁基甲酥,振荡5min,离心 5min(4000 r!/min),吸出特丁基甲酥层,弃去 然后再在磷酸盐缓冲溶液中加人2m特丁基甲酥重
GB/T20763一2006 复上述步骤 加人1mL5mol/1氢氧化钠溶液摇匀后加人10mL特丁基甲雕,振荡15min,离心 nmin(4000:/min) 定量吸取特丁基甲醒转移到一个干净的10mL的离心管中 在40C条件下用氮 5 吹仪蒸发至干 在浓缩至干的提取物中加人1000l流动相溶液(4.17),进行涡流混合,超声处理 1×13 0min 用0.24m mm的聚四氟乙烯注射式过滤器过滤样液,将样液转移到试样瓶中,供液相色 谱-串联质谱测定 7.3色谱测定 7.3.1液相色谱条件 色谱柱;InertsilODs-3,5m,l50mm×2.1mm(内径),或相当者; a 柱温;35C; bb 进样量;20L. 色谱柱总流量:200aL/nmin; d 流动相及梯度,见表1 表1流动相及梯度 步骤 运行时间/nminm 流动相A/% 流动相B/% 流动相C/(% 70 15 15 0.00 15 15 4.00 70 40 9.00 15 25.00 35 15 50 28,00 15 20 50 30.00 70 30 15 70 60.00 15 15 7.3.2质谱条件 离子源电喷雾离子源; a b)扫描方式;正离子扫描 检测方式:多反应检测(MRM) 电喷雾电压(IS):5000V; 雾化气压力(CAs1);482.6kPa 气帘气压力(cUR):68.9kPa 辅助气压力(CAS2):482.6kPa; g 离子源温度(TEM);700C; h 接口加热:ON; 定性离子对、定量离子对、采集时间(Dwell),去簇电压(DP)、碰撞气能量(CE)、人口电压(EPy 及碰撞室出口电压(cXP),见表2
GB/T20763一2006 表2六种镇定剂及其代谢产物和卜-阻断剂的质谱参数 镇定剂以及 定性离子对 定量离子对/采集时间去簇电压 碰撞气 人口电压/出口电压 代谢物名称 能量/ amu amu mms 327.40/58.20 327.40/58.20 200 61.00 68.00 5.00 10.00 乙酰丙嗓 acetoprommaizine 327.40/86.20 327.40/86.20 200 61.00 68.00 5.00 15.60 319.30/58.20 319.30/58.20 200 60,00 66.00 10.00 10.00 氯丙嗓 ehlorpromazine 319.30/86.2o 319.30/86.20 200 60.00 30.00 10.00 7.00 376.40/165,40376.40/165.40 200 70.00 35.00 ll.00 1l.00 氟咏醉 122. haloperidol .9o376.40/122.0 376，40/ 200 70.00 57.00 l1.00 ll.00 341.20/58.20 341.20/58.20 200 64.00 59.80 0.6o 9.70 丙酰二甲氨 PropIonylpromazln 34l.20/86.30 34l.20/86.30 200 64.00 30.00 10.60 15.00 221.30/90.l10 221.30/90.10 200 85.00 33.00 l1,00 8,00 甲苯嚓嗓 xylazine 221.30/164.40 85.00 11.00 221.30/164 200 38.00 3.00 328,40/121.00328,40/121.00 200 60.00 30.00 11.00 10.00 阿扎咏隆 azaperone 328.4/147.l10 328.40/147.10 200 60.00 30.00 ll.00 10.00 11.0o 330.30/121.00 200 330.30/121.00 60.00 35,00 12.00 阿扎喉醉 330.30/149.1o330,30/149.10 200 60.00 40.00 11.00 12.00 azaperol 330.30/312.20330.30/312.20 200 60.00 25.00 l1.00 10.00 299.50/116.20299,50/116.20 200 83.00 30.00 l1.00 11.00 咔陛心安 carazolol 299.50/222.4o 299.50/222.40 83.00 1l1.0o 200 30.00 6.00 7.3. 3 液相色谱-串联质谱测定 7.3.3. 定性测定 每种被测组分选择1个母离子,2个以上子离子,在相同实验条件下,样品中待测物质和内标物的 保留时间之比,也就是相对保留时间,与混合基质标准校准溶液中对应的相对保留时间偏差在士2.5% 之内;且样品谱图中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的混合基质标准校准溶液谱图中对应的定 性离子的相对丰度进行比较,若偏差不超过表3规定的范围,则可判定为样品中存在对应的待测物 表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 >2050 >10~20 >102o 相对离子丰度 50 允许的最大偏差 士20 士25 士30 士50 7.3.3.2定量测定 用混合标准溶液(4.21)分别进样,以峰面积为纵坐标,工作溶液浓度为横坐标,绘制标准工作曲线， 用标准工作曲线对样品进行定量,样品溶液中镇定剂及其代谢产物和含阻断剂的响应值均应在仪器测 定的线性范围内 在上述的色谐条件和质谐条件下,六种镇定剂及其代谢产物和!阻断剂的参考保留 时间见表4 六种镇定剂及其代谢产物和}阻断剂的标准总离子流图见图A.1 六种镇定剂及其代谢 产物和P-阻断剂的添加浓度及其平均回收率的试验数据参见表B.1
GB/T20763一2006 表4六种镇定剂及其代谢物和卜阻断剂参考保留时间 镇定剂及其代谢产物 镇定剂及其代谢产物 保留时间/min 保留时间/minm 和-阻断剂 和-阻断剂 甲苯嚷嗓 氟噪唉醉 5.09 15.87 9.17 分 阿扎眼醉 乙肤丙嗓 16. 咔哗心安 11.33 丙酰二甲氨基丙盼嚓嗓 18.82 阿扎噪隆 12.99 氯丙嗓 19.72 平行试验 按照以上步骤,对同一试样进行平行试验 7.5回收率试验 空白样品中添加标准溶液按7.1和7.2操作,测定后计算样品添加的回收率 结果计算 试样中每种镇定剂及其代谢物和仔-阻断剂残留量利用数据处理系统计算或按式(1)计算 1000 X=c× 1000 式中 试样中被测组分残留量,单位为微克每千克(4g/kg); 从标准曲线上得到被测组分游液的浓度,单位为纳克每毫升(ng/nL) 样品溶液定容体积,单位为毫升(mL); m 样品溶液所代表试样的质量,单位为克(g). 注:计算结果应扣除空白值 精密度 本标准的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的,其重复性和再现性的 值是以95%的可信度来计算 9.1重复性 在重复性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r,猪肾组织中六种镇定剂 及其代谢物的含量范围及重复性方程见表5 表5猪肾组织中六种镇定剂及其代谢物和卜阻断剂的含量范围及重复性和再线性方程 镇定剂及其代谢 再现性限R 含量范围/4g/kg) 重复性限" 物和-阻断剂 乙酰丙嗓 0.7504.800 尸=0.548lm一0.2456 lgR=0.9549lgm十0.0396 氯丙嗓 0.7504.800 =0.4736m-0.1775 R=0.4384m十0.122 氟噪唁醇 0.1500.960 lg"=0,9429lgm一0.2700 lgR=0,9702lgm一0,213 0.7504.800 =0.3609m+0.0858 R=0.482lm十0.0048 丙酰二甲氨基丙吩嚷嗓 甲苯嚓嗓 0.375~2.400 0.3492m一0.0062 R=0.4150m一0.0020 阿扎噪降 0.3001.920 0.4314川一0.0707 R=0.4547m一0.0756 阿扎哌醇 .225~1.440 gr=1.3616lg-0.5490 lgR=0.9467lgm一0.4845 咔陛心安 0.7504.800 =0.2433m十0.0504 1.1332lgm一0.4501 lgR 注:朋为两次测定结果的算术平均值
GB/T20763一2006 如果差值超过重复性r,应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定 9.2再现性 在线性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R,猪肾组织中六种镇定剂及 其代谢物的含量范围及再现性方程见表5
GB/T20763一2006 附 录 A 资料性附录 标准物质总离子流图 六种镇定剂及其代谢物和-阻断剂标准物质总离子流图,见图A.1 1.24e6， 15.87 1.20ef- 1.15e6 1.l0e6 1.05e6 1.00e6 9.50e5 9.00es 8.50e5 9.17 12.99 8.00e5 7.50e5 7.00e5 6.50e5 6.00e5 5.50e5 5.00e5 4.50e5 5.09 4.00e5 11.33 3.50e5 h6.丽8B 3.00e5 2.50e5 19.72 2.00e5 1.50e5 1.00e5 5.00e" 0.00" 的 t/min 甲苯嚷嗓5.09nmin 氟哌醇15.87nmin -阿扎睬醇9.17min; 乙酰丙嗓16.55min; -咔陛心安11.33nmin; -丙酰二甲氨基丙吩嚷嗓18.82min -阿扎噪隆12.99min 氯丙嗓19.72min 图A.1六种镇定剂及其代谢物和卜阻断剂标准物质总离子流图
GB/T20763一2006 附录 B 资料性附录 收率 六种镇定剂及其代谢物和3-阻断剂添加浓度和平均回收率数据,见表B.1 表B.1六种镇定剂及其代谢物和卜-阻断剂添加浓度和平均回收率数据 猪肾中镇定剂和g阻断剂 猪肉中镇定剂和阻断剂 添加浓度 镇定剂以及 代谢物名称 平均回收率/(% 平均回收率/%y g/kg 0.750 101.0 97.2 1.500 78.7 94.9 乙酰丙嗓 3.000 85.2 84.9 4.800 86.7 92.6 0.750 99.9 99.5 1.50o 80.6 96.9 氯丙嗓 3.000 93.2 94.1 4.80o 91.7 97.5 0.15o 81 9 100.0 83." 99.4 0.300 氟噪嶙醇 0.600 98.9 101.7 0.96o 91.9 88." 0.750 101.2 102,4 丙酰二甲氨 5 1.500 81. 96.8 基丙吩嚷嗓 3.000 88.0 83.4 85. 92." 4.800 0.375 87.0 94.8 0.750 95.5 89.4 甲苯嚷嗓 1.500 98.0 98.2 2.400 85.7 102.3 82.2" 97.0 0.300 0.600 93.6 101.1 阿扎啄隆 103.2 0.0 1.200 1.920 99.6 91.6 0.225 88.5 98.7 0,450 91.9 98,2 阿扎噪醇 96." 0.900 95.8 1.440 102.4 93.7 0.750 95.5 105.8 1.500 83,3 70.1 咔坐心安 3.000 102.1 101.6 4.800 97.7 99,2