GB/T38481-2020
微生物超低频突变测定双重测序法
Determinationofultralow-frequencymutationsformicroorganisms—Duplexsequencing
- 中国标准分类号（CCS）A21
- 国际标准分类号（ICS）07.080
- 实施日期2020-11-19
- 文件格式PDF
- 文本页数6页
- 文件大小400.02KB
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微生物超低频突变测定双重测序法
国家标准 GB/T38481一2020 微生物超低频突变测定双重测序法 Determinationofultralow-frequenymutationsformicr0organismms Duplexsequeneing 2020-11-19发布 2020-11-19实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标涯花管理委员会国家标准
GB/38481一2020 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准由标准化研究院提出并归口 本标准起草单位;清华大学、洛阳华清天木生物科技有限公司、江汉大学、标准化研究院
本标准主要起草人:张、邢新会,李梅、剪兴金、王立言、郭肖杰、张乐乐、彭海、马爱进
GB/38481一2020 微生物超低频突变测定双重测序法 范围 本标准规定了用双重测序法测定微生物超低频突变的方法
本标准适用于微生物基因组或基因片段超低频突变的测定
规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
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GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件
3.1 超低频突变ultralow-frequeneymutations 化学、物理或生物因索导致微生物DNA发生的频率低于1×10-"的永久性改变
3.2 条形码标签barcdelabel 接在传测DNA片段两侧的核苷酸片段,用以标示同一扩增家族的DNA.,协助进行突变位点的 确认
3.3 互补标签家族complementarytagfamily 所有含两端互补条形码标签的DNA片段
3.4 双链同源序列doulestrandconsensussequenees;DcSs 带有相同条形码标签的双链DNA序列,包含反向互补链
原理 在待测DNA片段两端接上一段12nt随机且互补的双链核苷酸条形码标签,然后对所有带有条形 码标签的序列进行双重的高通量测序
利用12nt随机互补标签,排除掉测序文库制备过程中所引人 的突变,进而准确检测突变位点和突变率
5 试剂 除非另有规定仅使用分析纯试剂
5.1水
GB/T6682,一级 5.2接头链标签序列:
GB/T38481一2020 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3' a b)5'-TcTTCTACcAG:cANNNNNNNNNNNAGATccGAAGAGcACcACG;TTGAACTccAGTcAC-3
N为A、T,C或G,由12个随机碱基组成标签片段
将寡核苷酸溶解于Tris-EDTA缓冲液(5.8)或纯水中至终浓度1004mol/L,并放置于一20u 保存
5.3接头链扩增引物序列 5'-AATGATACGGcGAcCACCGAG-3' a b5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGC-3
X为按样品需求设计的文库标记序列
将寡核苷酸溶解于Tris-EDTA缓冲液(5.8)或纯水中至终浓度204mol/L,并放置于一20C保存 5.4基因提取试剂盒
尚通励谢序建库试剂众 5.5 5.6DNNA分选磁珠试剂盒
5.7DNA分析试剂盒
三羚甲基氨基甲烧乙二胺四乙酸(TieEDT)缓冲液.pH&0 由10mmol/L的分析纯Tris和 5.8 0.1mmol/儿的EDTA配制,调整pH值至8.0.
6 仪器设备及器具 6.1PCR扩增仪
6.2磁性分离器
6.3高通量测序仪 6.4核酸分析系统 6.5电子天平;精度为0.01g
样品制备 7.1DNA提取 利用微生物基因组或质粒提取试剂盒对待测样本进行基因组或质粒DNA提取操作,最后使用 50L的无菌双蒸水进行DNA洗脱
提取得到的DNA样品使用核酸定量仪检测核酸的浓度和纯度
7.2DNA片段化和末端修复 利用高通量基因测序建库试剂盒,将待测样品DNA片段化至100bp~1000bp,将末端修复为 A尾
8 接头条形码标签的合成 8.1退火 将浓度100Amol/L的两个接头链寡核苷酸片段各取100L进行退火,在95C下加热5nmin后， 自然降温,并静置1h
8.2延伸 将8.1中得到的产物按试剂说明与脱氧核糖核苷三磷酸混合物(dNTPs)和克列诺酶混合均匀,分 装至两个0.2mL.的PCR管中并在37c下孵育1h
GB/38481一2020 8.3DNA回收 使用无水乙醉醇沉淀DNA,并加人200L纯水溶解
8.4切 用眼制性内切酶HpyCH4匪对DNA产物进行酶切
将混合物分装至4个02mL的PCR管中 并在37C孵育16
8.5纯化 加人并均匀混合50AL的3nmol/L.乙酸钠溶液(pH5.2),最终体积为550AL
将混合溶液平分到 1.5ml的具塞离心管内,每管275AL,并加人625L室温的无水乙醇到各管中
充分混匀,并以大于 10000r/min的转速在4C下离心30min
移除上清液后,加人1mL的75%(体积分数)乙醉至各管中
充分混匀,并立即以大于10000r/min 的转速在4C下离心30nmin. 移除上清液后,在纸巾上倒置试管10min以干燥,接着正置5min. 加人100L的Tris-EDTA缓冲液至上一步骤产物中并混合均匀
将所有试管集在一起,最终体 积为200ML,终浓度约为50mol/L,放人-20C的冰箱中保存
接头条形码标签与待测样本DNA的连接和扩增 9.1连接 将互补条形码标签与DNA片段化和末端修复产物按总浓度20:1混合后,利用T4DNA连接酶 连接,在25C孵育15min 9.2分选 利用DNA分选磁珠试剂盒分选得到的产物,获得长度为200bp900bp的DNA片段,并以DNA 试剂盒定量DNA浓度
9.3PCR扩增 以分选产物为模板,接头链扩增引物序列为引物,按每20万读数数据量取1amolDNA样量进行 PCR扩增,扩增程序根据所选用高保真DNA聚合酶的要求设定
10高通量测序 利用高通量测序试剂盒对扩增得到的PCR产物进行高通量测序,每个待测样品测序碱基数量设置 为大于或等于10Gb 结果分析 1 对高通量测序数据进行清理,然后按下列程序进行数据分析 根据随机标签进行互补标签分类,每一个家族需包含双向互补序列
互补标签家族大小分布 a 在排除1之后,最大峰值分布应于6~12之间
b 双链同源序列在同一位点识别出突变才视为真正的突变位点
GB/T38481一2020 12 结果计算与表述 12.1 结果计算 突变率按式(1)计算 N M一 N 式中 M 突变率 N
双链同源序列突变位点数; N， -不含标签的测序核肯酸总数
12.2结果表述 结果表述为待测样本的突变率M
微生物超低频突变测定双重测序法GB/T38481-2020
随着生物技术的快速发展，对微生物进行基因组学研究已经成为一种重要的手段。然而，微生物在环境中的数量往往非常少，导致其超低频突变的检测相对困难。近年来，双重测序法被广泛应用于这一领域，并且成为微生物超低频突变测定的一种常用方法。
GB/T38481-2020标准是我国针对微生物超低频突变测定双重测序法制定的标准，该标准规定了双重测序法的流程、数据分析、结果解释等方面的内容。其中，双重测序法的核心原理是利用两次独立的PCR扩增，将同一个微生物菌落的DNA分别扩增为两个PCR产物，然后进行双向测序，从而获得高度准确的突变检测结果。
GB/T38481-2020标准对双重测序法的实施提出了严格的质量控制要求，包括样品处理、PCR反应、测序数据质量控制等多个方面。此外，该标准还规定了分析方法和结果解释标准等内容，以保证检测结果的准确性和可靠性。
总之，GB/T38481-2020标准中关于微生物超低频突变测定双重测序法的内容十分详细，并且涵盖了从实验设计到数据分析的全过程。该标准的发布将有助于促进微生物基因组学研究的发展，并且为微生物致病机理、耐药性等方面的研究提供重要的技术支持。
