草莓角斑病菌检疫鉴定方法

草莓角斑病菌检疫鉴定方法

国家标准 GB/T29429一2012 草莓角斑病菌检疫鉴定方法 DeteetonamdidentifieatonoXanthomoasfragariaeKemnely&King 2012-12-31发布 2013-03-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T29429一2012 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口 本标准起草单位;江苏出人境检验检疫局、山东出人境检验检疫 局、检验检疫科学研究院 本标准主要起草人:刘天鸿、邵秀玲,赵文军、杨万风、厉艳、魏厚德、沙天慧、孟祥龙
GB/T29429一2012 草莓角斑病菌检疫鉴定方法 范围 本标准规定了草莓角斑病菌Xan anthomonasfrugariaeKennedy&.King的检疫鉴定以形态学特征 生物学特征和PCR特异性反应为依据,明确了样品采集、病原菌分离、致病性测定、PCR反应、样品保 存的方法 本标准适用于草莓种苗中草莓角斑病菌的检疫和鉴定 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T4789.282003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂 sN/T1157进出境植物苗木检疫规程 草莓角斑病菌基本信息 中文名;草莓角斑病菌 学名:Xanthomonas/hragariaeKennedy& King strawbery 病害英文名:Angularleafspotof 属于原核生物界Procar 薄壁细菌门Giracilicutes，暗细菌纲Scotobacteria,假单胞杆菌科 yote Pseudomonadaceae,黄单胞杆菌属Xanthomonas 该病菌可通过雨水和田间灌溉飞溅作局部传播,扩散,携带病菌的草莓苗以及夹杂在草莓苗中的病 残体都可能随贸易作短距离和长距离的运输传播 草莓角斑病菌的其他信息参见附录A 方法原理 根据草莓角斑病菌的危害症状采集样品,通过实验室分离、培养和致病性测定,以及分子生物学测 定等方法,依据病害的症状、病原菌的形态特征、生物学特性,生化特性、致病性测定,以及分子生物学特 征进行判定 仪器和用具 生物显微镜、生化培养箱、,高压灭菌器、电子天平(感量0.01mg)、恒温振荡培养箱、超净工作台、 PCR仪、电泳装置、恒温水浴锅、高速冷冻离心机、移液器、移液器枪头,研钵、量简、烧杯,培养皿、PCR 管、离心管,接种针,玻璃棒,剪刀等 主要试剂 蛋白、酵母膏、蔗糖、葡萄糖,琼脂粉、冰乙酸、乙醇、乙二胺四乙酸(EDTA、十六婉基三乙基澳化
GB/T29429一2012 铵(CTAB)、三胫甲基氨基甲炕(Tris)、十二婉基磺酸钠(SDS)、液氮、酚、三氯甲婉、异戊醇、异丙醇,琼 脂糖(电泳用,澳化乙锭(EB)、TaqDNA聚合酶、氯化钾(KCI)、磷酸氢二钾(K,HPO.、氯化钠 NacD),磷酸氢二钠(Na.IHPo)),氧化钱(MgC!,),硫酸镁(MgSo 7H.O)、硝酸钠(NaNO.、乙二胺 四乙酸钠(Na;EDTA)、溴酚蓝、蛋白酶K、RNaseA、10×PCR缓冲液、dNTP(dATP,dTTP,dCTP dGTP) 检疫鉴定方法 7.1现场检疫 抽样数按sN/T1157中规定的方法进行 在现场检疫时,应仔细检查草莓苗叶和茎有无病变症状,如在草莓叶面上发现水溃状红褐色不规则 形病斑,叶背溢出菌脓,植株生长点变黑等可疑症状时,应取样作实验室鉴定 在产地检疫和隔离试种期间,还要注意检查有无淡红褐色干枯病叶或生长点死亡的植株,当发现可 疑症状应取样作实验室鉴定 7.2病原菌分离纯化 选取新发病的、带有水溃状病斑的病叶,用70%的乙醉进行表面消毒,切取病健交界处,无菌水冲 洗后碾碎,置于Ps缓冲溶液(参见附录B)中10min一15min 在无菌操作条件下吸取稀释液均匀涂 布于wILBRINK-N培养基(参见附录B)平板上,置于25C培养5d7d,然后再进行三次的纯化,最 后获得纯菌株 7.3病原菌形态观察及生理生化测定 7.3.1形态观察 对分离纯化获得的纯菌株,经染色制成玻片,在显微镜下观察形状,测量大小 7.3.2 菌落颜色 将菌株在wILBRINK-N或YPGA培养基(参见附录B)上划线培养,置于25C培养5d~7d,观 察菌落的颜色和形状 7.3.3生理生化测定 该菌生理生化测定见附录C 致病性测定 将wLBRINK-N或YPGA培养液(参见附录)中培养3d一5d的菌株,用PBs缓冲溶液稀释到 10CFU/mL,选取完全健康的草莓感病品种,用蘸取悬浮液的接种针小心地扎刺新生叶面,每片叶扎 刺5~10次,最好不要扎穿叶子,设置五个重复,以PBS缓冲溶液为对照 接种后用塑料袋罩住植株， 使植株置于20C一25、相对湿度>80%的隔离温室里生长4周,每天观察并记录发病情况,出现症 状后,用7.2方法进行病原菌再分离、纯化 7.5PCR法检测 该检测方法见附录D.
GB/T29429一2012 鉴定特征 8.1症状特征 草莓角斑病菌初侵染时在叶片下表面出现1 mm4mm大小的水溃状红褐色不规则形病斑,病斑 扩大时受细小叶脉所限呈角形叶斑 病斑在可见光下呈透明状,在反射光下呈暗绿色 病斑逐渐扩大 后融合成一体,渐变淡红褐色而干枯 湿度大时叶背可见溢出菌脓,干燥条件下成一薄膜 病斑常在叶 尖或叶缘处,严重时使植株生长点变黑枯死,叶片发病后常干缩破碎形成孔洞 在适宜的条件下,花尊 也能受侵染 另外,该细菌还可导致维管束病变 病原特征 无炎版杆菌,单个,成双或成短链,具单根极鞭,革兰氏染色阴性,大小约为0.44mX1.3 m 病 菌生长较慢,在培养基上4d一5d才能形成菌落 营养琼脂上,蒲落圆屋顶形.边缘整齐规则.有光泽 黄色奶油状 好氧菌,氧化钠最大耐受力为0.5%一1.0%,生长最适温度25C,超过33C不能生长 明胶液化、淀粉水解,不水解七叶苷,不从阿拉伯糖,半乳糖、海藻糖、纤维二糖溶液产酸,不能利用天冬 酰胺作唯一碳源和氮源 8.3致病性特征 针刺接种后,在7d左右应出现水溃状红褐色病斑,这些病斑逐渐扩大坏死,经病原菌再分离获得 的纯菌株应具有与原菌株一致的病原特征 而所设的阴性对照并没有出现相应症状 8.4分子生物学特征 测试菌株经PCR反应后,如果PCR产物与阳性对照条带一致(537bp),且阴性对照和空白对照均 没有相应条带,则能证明所测菌株为阳性 否则,则判断为阴性 结果评定 根据草莓角斑病菌的鉴定特征(见第8章)进行综合判定,凡症状,病原特征、生理生化特性、致病性 特征以及分子生物学特征与第8章描述相符,可以判定为草莓角斑病菌,否则结果判定为不是 l 样品保存 经检疫鉴定后,应妥善保存样品及菌株,以备复验,谈判和仲裁 保存期满,需经灭菌后方可处理 11 菌株保存 从检测样品中分离到并鉴定为草莓角斑病菌的菌株,应妥善保存 将菌株转接到wILBRINK-N 或YP(GA培养基斜面上,25C恒温培养5d~7d 然后置于4C冰箱中保存,定期(30d60d)转接， 防止病菌死亡;必要时将菌株用真空冷冻干燥机制成冻干粉，一80C下长期保存
GB/T29429一2012 附 录A 资料性附录 草莓角斑病菌的相关资料 A.1分布 以色列、台湾,比利时,法国、希腊、意大利、葡萄牙,罗马尼亚、西班牙,瑞士,埃塞俄比亚、留尼 旺,澳大利亚,新西兰,美国(加利福尼亚州、佛罗里达州、肯塔基州明尼苏达州威斯康星州,阿根廷、 巴西、智利、厄瓜多尔、乌拉洼、委内瑞拉 A.2寄主范围 草莓(Fragariaananassa)是该病原菌的主要寄主 病原菌对草莓属(Fragaria)的其他品种的致 病性变化较大 人工接种情况下,弗州草莓(F irginiana),野草莓(F.vesca)、金露梅(Polenilla fruicosa)和委陵菜P.glandwlosa)均可被草莓角斑病菌侵染 草莓属植物中仅麝香草莓(F ta)对草莓角斑病菌免疫 nosc/hata A.3生物学特性 病叶残渣和带菌植株是发病的初次侵染源 在病残叶和土壤中,病菌能够存活到下茬作物;在实验 室保存的干燥病叶片中,病原菌至少可存活两年半 在草莓开始生长时,病原菌由病残叶传播到幼叶 上,细菌可从侵染区沿着幼叶基部叶脉扩散,在田间传插主要靠雨水、喷灌及风的作用传播 病原菌可 通过气孔侵人,也可经过局部伤口或下方的病叶侵染,在整个生长期发生多个侵染循环,病菌可侵染植 物的花,但不侵染果实 中等偏低的日温(大约20C)夜间低温及较高的湿度更有利于该病菌的侵染
GB/T29429?2012 ? B ?? ????? B.1wILBRINK-N 10.0g/L,?5.0g/L,0.5g/L,?0.25g/L,0.25g/L,? 15,0g/L,pH7.2 B.2wLBRINK-N? 10.0g/L,?5,0g/L,0.5g/L,?0.25g/L,0.25g/L,pH7.2 B.3YG:A 20.0g/L,?10.0g/L,?5.0g/L,?15.0g/L,pH7.2 B.4YPGA? 20.0g/L,?10.0g/L,?5.0g/L,pH7.2 B.5PBs? ?8.0g/L,?0.2g/L,2.9g/L,0.2g/L,pH7.2
GB/T29429?2012 ?c 淶?? ? C.1?? GB/T4789.28?20032.2涨?С C.2??? GB/T4789.28?20032.7涨?С C.3???? ????????(X.arboricolapv.fragariae)?(X campesris)C.1 C.1???????? ? ??? ???? ? ND 5C 2%NaCl ?? ? ? ? ND ? ? ND ? ? ? ND ?? ?;NDδ?;?90%??;?90%??;?11%89%??
GB/T29429一2012 附 录D 规范性附录 PCR法检测 D.1病原细菌DNA的提取 取待测样品或分离培养菌株,利用DNA提取试剂盒方法提取DNA,并测定DNA浓度，一20C保 存备用 也可直接用培养的菌株稀释悬浊液作为模板进行CR反应 D.2引物序列 正向引物:XF9:5'-TGGGCCATGCcGGTGGAACTGTGTGG3'’;反向引物:XF11l:5'-TAC CCAGCCGTCGCAGACGACCGG-3’ D.3PCR反应体系及参数 D.3.1CR反应体系 见表D.1 表D.1PCR反应体系 试剂名称 终浓度 10× PCR反应缓冲液 2.5mmol/L MgC dNTPs 0.2mmol/ 正向引物 0.2ammol/1 反向引物 0.24nmol/L TaDNA聚合 2.5U DNA模板 1nl 补H.o 至 50Al D.3.2阴性对照,阳性对照和空白对照的设置 阴性对照:以待测健康的草莓叶片DNA为模板;阳性对照:采用草莓角斑病菌或含有待测基因序 列的质粒;空白对照;设两个,一是提取DNA时设置的提取空白对照(以水代替样品),二是PCR反应 的空白对照(以水代替DNA模板). D.3.3CR的反应参数 min,35个循环 72C/5minr 95/2min;94C/30s;65/30s;72/1 n,最后4C保温 注:不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整
GB/T29429一2012 D.3.4琼脂糖凝胶电泳 制备2%的琼脂糖凝胶,用DNAMarker作为相对分子质量标记,进行电泳分析,电泳结束后在凝 胶成像仪的紫外透射光下观察并拍摄记录 D.4结果判断 若有537bp大小的产物带出现,可判定为阳性

草莓角斑病菌检疫鉴定方法GB/T29429-2012

草莓角斑病是一种由草莓角斑病菌引起的疾病，在草莓种植业中较为常见。该病菌能够通过种子、苗木、土壤等途径传播，对于草莓产业造成了严重威胁。

为了防止草莓角斑病的扩散，国家制定了严格的检疫鉴定标准GB/T29429-2012。该标准规定了草莓角斑病菌的检测方法和鉴定标准，包括样品采集、处理、PCR扩增、电泳分析等环节。

具体来说，草莓角斑病菌的检测需要采集草莓样品，包括叶片、茎、根等部位。采样时要选择有病征的部位，并注意避免受到污染。采集的样品要立即送到专业实验室进行分析处理。

在实验室中，需要对样品进行提取、PCR扩增、电泳分析等步骤。其中PCR扩增是最关键的环节之一，该步骤能够快速、高效地检测出样品中是否含有草莓角斑病菌的DNA序列。

针对PCR扩增结果，需要进行电泳分析，以确定扩增产物的大小和数量。通过对扩增产物的分析，可以判断样品中是否存在草莓角斑病菌。

除此之外，还需要进行生物学特性鉴定和分子生物学鉴定等环节，来确认样品中草莓角斑病菌的种类和数量等信息。

总之，草莓角斑病的检测与鉴定是一个非常严谨的过程，需要专业实验室和专业人员进行操作。只有遵循标准GB/T29429-2012的规定，才能保证检测结果的准确性和可靠性。

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2022/10/24 7:30:17 现行