饲料中赭曲霉毒素A的测定

饲料中赭曲霉毒素A的测定

国家标准 GB/T19539一2004 饲料中糍曲霉毒素A的测定 DeterminationofochratoxinAinfeeds 2004-06-10发布 2004-10-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国国家标雅花管理委员会国家标准
GB/T19539一2004 前 言 本标准中的薄层色谱方法和酶联免疫吸附测定方法主要依据GB/T5009.962003《谷物和大豆 中糍曲霉毒素A的测定》中薄层色谱方法和卫生部食品卫生监督检验所建立的酶联免疫吸附法 本标 准规定以薄层色谱法为仲裁方法,酶联免疫吸附测定法为快速筛选法 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口 本标准由江苏省微生物研究所负责起草 本标准主要起草人;必晓黎、袁建兴,李利东、丁贵平,成恒嵩
GB/T19539一2004 饲料中赭曲霉毒素A的测定 范围 本标准规定了精曲霉毒素A(OehratoxinA.以下简称OA)的薄层色谱测定方法和酶联免疫吸附测 定方法 本标准适用于配合饲料,饲用谷物原料中oA的测定 薄层色谐测定方法的最低检测量为2g,酶联免疫吸附测定方达的最低检测量为0.05ng 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样方法 薄层色谱法(仲裁法) 3.1原理 试样中的OA经提取、液-液分配萃取、浓缩,然后进行薄层分离,限量定量,或用薄层扫描仪测定荧 光斑点的荧光强度,外标法定量 3.2试剂与材料 所用试剂除另有规定,均使用分析纯试剂 水符合GB/T6682中一级水的规定 3.2.1石油酥 3.2.2甲醉溶液(55十45). 3.2.3三氯甲烧 3.2.4苯-冰乙酸(99+1). 3.2.540g/几叙化钠溶液 3.2.6无水硫酸钠.650C灼烧4h冷却后贮于干燥器中备用 3.2.7展开剂(用时选择一种) 甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(6+3+l.2+0.06) a b)甲苯-乙酸乙酯-甲酸(6十3十1.4); 苯-冰乙酸(9十1) c 3.2.8显色剂;碳酸氢钠乙醉溶液(在100ml水中溶解6.0g碳酸氢钠,加20ml乙醇) 薄层板;称取4区硅胶G,加约10mL.0.5%梭甲基纤维素钠水溶液于乳钵中研磨至糊状 3.2.9 立即 倒人涂布器内制成10cm×20cm、厚度0.3mm的薄层板,在空气中干燥后,用甲醇预展薄层板,除去 杂质,吹干,在105C~110C活化1h,置于干燥器内保存备用 3.2.10oA标准储备溶液 警告 凡接触oA的容器,需浸入4%次氯酸钠(NaoCD)溶液,半天后清洗备用 为了安全,分析人员操作时要带上医用乳胶手套 称取适量的OA标准品,用苯-冰乙酸(3.2.4)配制成约10g/ml.oA贮备液 贮备液置于4C冰
GB/T195392004 箱中避光保存 标定贮备液的浓度,用1cem石英比色杯,以苯-冰乙酸(3.2.4)为参比,在OA的最大吸收峰波长 333" nm处,测定吸光度值A 储备液中OA的含量(X)以微克每毫升4g/mlL)表示,按式(1)计算 AXMxl00 X，= 式中 -测定的吸光度值; M -OA的摩尔质量(M=403g/mol). OA在苯-冰乙酸中的分子吸收系数(e=555m/nmol); 比色杯的光径长度,单位为厘米(em) 3.2.11OA标准工作溶液:根据计算的OA标准储备液的浓度.精密吸取标准储备液(3.2.10)适量 用苯稀释成浓度为1.04g/m的标准工作溶液 3.3仪器与设备 3.3.1小型粉碎机 3.3. 电动振荡器 3.3.3薄层板涂布器 3.3. 玻璃器皿;分液漏斗,蒸发、,浓缩瓶 所有玻璃器皿均需用稀盐酸浸泡,依次用自来水、蒸僧水 4 冲洗 3.3.5快速定性滤纸 3.3.6展开槽:250mm×150mm×50mm(立式,具磨口). 3.3.7紫外光灯;波长365nm. 3.3.8点样器:1Al99l 3.3.9薄层扫描仪;配有求灯光源 3.4试样制备 按GB/T14699.1饲料采样方法取得试样,四分法浓缩减取约200g,经粉碎,混匀,装人磨口瓶中 备用. 3.5分析步骤 3.5.1试样处理 称取约20g试样(3,4)(精确至0.01g),置于200nml具塞锥形瓶中,加30ml石油哒和100ml 甲醉溶液(3.2.2),瓶塞盖紧 振荡30min后,通过快速定性滤纸滤人分液漏斗中,待分层后,放出甲醉 水层20mL,置于100mL 分液漏斗中,用pH试纸测试，一般为56 加人25mL三氯甲烧,振摇 2min,静置分层后,放出三氧甲婉层于另一个分液漏斗中,再用10ml三氯甲婉重复振摇提取甲醇水 层在用三氧甲婉振摇提取时,如发生乳化现象,可滴加甲醉促使其分层),将三氯甲婉层合并于同一分 液漏斗中,加人50ml一100mL氧化钠溶液(3.2.5)振摇,放置分层后,将三叙甲婉层放出,经装有约 20g无水硫酸钠的玻璃漏斗流人蒸发皿中,将蒸发皿置蒸气浴上通风挥干 用约8mL三氯甲婉分次 将蒸发皿中的残渣溶解,转人浓缩瓶中,置60C水浴减压浓缩至干,加人2mL苯-冰乙酸(3.2.4)溶解 残渣,摇匀,供薄层色谱点样用 3.5.2点样 在距薄层板下端1.5cm~2cm的基线上,以1cm的间距,用点样器依次点标准工作溶液(3.2.11 ng、7ng10ng)和试样液(3.5.l)20L 2L4aL、7LI0aL(相当于2ng、4 3.5.3展开 将薄层板放人有展开剂的展开槽中,展至离原点13cm~15cm,取出,吹干 3.5.4观察与确证 将展开后的薄层板置于波长365nm紫外光灯下,观察与OA标准点(4ng)比移值相同处的试样的
GB/T19539一2004 蓝绿色荧光点 若相同位置上未出现荻光点,则试样中的oA含量在本测定方法的最低检测量 100ug/kg以下 如果相同位置上出现荧光点,用显色剂对准各荧光点进行喷雾后吹干,观察荧光点由 蓝绿色变为蓝紫色且荧光强度明显加强可确证试样中含有OA 于荧光点下方用铅笔标记,待扫描定 量测定 3.5.5定量测定 3.5.5.1薄层扫描工作条件 光源;高压汞灯; 激发波长:365nm; 发射波长;450nm; 检测方式:反射 狭缝;可根据斑点大小进行调节 扫描方式;距齿扫描 3.5.5.2标准曲线绘制 以OA标准工作溶液质量(ng)为横坐标,以峰面积积分值为纵坐标,绘制标准曲线 3.6结果计算和表述 根据试样液荧光斑点峰面积扫描积分值从标准曲线上查出对应的OA质量(ng),试样中oA的含 量(X)以微克每千克(ug/kg)表示,按式(2)计算 m X "X 式中 V 一试样液(3.5.1)最后定容体积,单位为微升(L); V， 试样液点样体积,单位为微升(L); -从标准曲线上查得试样液点上对应的OA的质量,单位为纳克(ng); m 最后提取液相当试样的质量,单位为克(g) m0 计算结果表示到小数点后一位有效数字 3.7重复性 在重复性条件下获得的两次独立测试结果的相对差值不大于10% 酶联免疫吸附测定法(快速筛选法 原理 方法的检测依据是抗原-抗体反应 将OA抗体的羊抗体吸附在固相载体表面,加人OA抗体、酶 标OA结合物,OA标准或试样液,在OA抗体与固相载体表面羊抗体结合的同时,游离的OA,、酶标 OA结合物与结合在固体表面OA抗体竞争,未结合的酶标OA结合物洗涤除去 加人酶底物,在结合 酶的催化作用下,无色底物降解产生有蓝色物质 加人终止剂后颜色转变为黄色 通过酶标检测仪,在 450nm波长处测吸收值 吸光强度与试样中OA的浓度成反比 酶联免疫吸附测定法具有操作简单,快速灵敏，结果可靠的特点 目前有专门测定OA的酶联免疫 检测试剂盒的商品 在分析时适当参考操作说明书 4.2试剂与材料 4.2.1包被抗体的聚苯乙烯微量反应板24孔或48孔 4.2.270%甲醇溶液 4.2.3OA标准溶液;精密吸取标定后的标准储备液(3.2.10)适量,用甲醇溶液(4.2.2)配制成OA标 准溶液15,浓度分别为04g/L、1g/L、24g/L、44g/L,8g/L 4.2.4酶标抗原溶液:OA与辣根过氧化酶结合物
GB/T19539一2004 4.2.5抗体溶液:OA抗体 4.2.6柠檬酸缓冲溶液[c(Na.C,H.O=0.1mol/儿L，pH=4.0];称取10.1471只柠檬酸钠 Na,C;H.O2H.O),13.7642g柠檬酸(C;H.OH.O)加水溶解至1L 4.2.7底物溶液甲;四甲基联苯胺,用柠檬酸缓冲溶液(4.2.6)配成浓度为0.4g/1 4.2. 8 底物溶液乙;取1.5ml30%过氧化氢,用柠檬酸缓冲溶液(4.2.6)稀释至1L 4.2.9底物溶液:底物溶液甲与底物溶液乙1:1的混合液 4.2. 0 终止液;硫酸溶液(1十17) 4.3仪器与设备 44 .3.1酶标测定仪;带450nm波长 4.3. 小型粉碎机 4.3.350l,100L、1000L微量移液器 44 .3.4电动振荡器 4.3.5玻璃器皿.:50mL锥形瓶、漏斗、量筒 4.3.6快速滤纸 4.4试样制备 同3.4 4.5分析步骤 4.5.1试样处理 称取约5g试样(4.4)精确至0.01g),置于50ml具塞锥形瓶中,加人12.5ml 甲醉溶液 (4.2.2).密塞 振荡器(4.3.4)提取5min 提取液通过快速滤纸过滤,取1ml滤液加9mL蒸水 稀释,摇匀,为试样液 4.5.2分析前注意事项 分析前将所有试剂平衡至室温;分析后立即将所有试剂放回2C8C冰箱;在所有培育中,避光 盖上微孔板盖 4.5.3定位 根据需要设定限量法(如表1)和定量法(如表2) 取足够数量的微孔置微孔架上,标准品和试样做 两个平等实验,记录标准品孔和试样孔的位置 限量法时控制标准品孔号中的浓度为限量值/稀释因 子,并通过调节稀释因子使之浓度在04g/儿8ug/L范围内 表1限量法微孔定位 孔 10 12 标准溶液1 标准溶液4 待 测 试 样 液 04g/L 44g/L 表2定量法微孔定位 孔 12 标准溶液l~5 测 试 样 待 液 0ug/L lg/L 24g/L 4ug/1 s丝g/I. 4.5.4加试剂 在每孔中依次加人试剂;加人50n标准溶液(4.2.3)或试样提取液(4.5.1)至相应微孔中;加人 50L酶标结合物(4.2.4)到每个微孔中;再加人50LOA抗体(4.2.5)到每个微孔中
GB/T19539一2004 4.5.5反应 将酶标板轻轻摇晃,使孔中的试剂摇匀,置温度18C30C培育反应10min 4.5.6洗涤 将微孔中液体倾倒到水池内,倒置微孔支架,在干净纸巾上轻拍,除去所有残留的液体,用移液器加 蒸馏水250l到每个微孔中,洗板,放置2min,再排空液体,重复洗涤3次 4.5.7显色 加100L底物溶液(4.2.9)到每孔中,充分摇匀,置18C30C恒温箱中,反应5min 4.5.8终止 加100L终止液(4.2.10)到每孔中,摇匀 4.5.g测定 在450nm处,以空气为空白调零,测定吸收值 在6omin内读数 4.6结果计算和表述 4.6.1限量法 若试样孔的吸收值小于标准品孔的吸收值,即A试样礼A标着礼,则小于或等于所设限量值,为阴性 限量值为标准值(ug/L)乘以稀释因子 按4.5.1操作,稀释因子为25,若控制标准值为44g/I 时,试样中OA的限量在1004g/kg 4 .6.2定量法 百分吸收值;所得的标准或试样的吸收值除以第一个标准(0标准)的吸收值再乘以100,作为百分 吸收值A%,按式(3)计算 A%=×100 3 式中 标准品或试样的吸收值; 空白的吸收值 A 标准曲线的绘制:所计算的百分吸收值对应OA浓度(ug/L.)的半对数坐标作标准曲线图.曲线在 lng/kg8ng/kg范围内应当成线性 根据试样的百分吸收值,通过标准曲线,查得相对应浓度 试 样中OA的含量(X)以微克每千克(ug/kg)表示,可按式(4)计算 cXXn X 式中 从标准曲线上查得相对应试样提取液(4.5.1)中OA浓度,单位为微克每升(g/L) 试样提取液(4.5.1)体积,单位为毫升(mL.); 试样稀释倍数 试样质量,单位为克(g). 7 计算结果表示到小数点后一位有效数字 重复性 在重复性条件下获得的两次独立测试结果的相对差值不大于15%