奥尼罗非鱼亲本保存技术规范

奥尼罗非鱼亲本保存技术规范

国家标准 GB/T19528一2004 奥尼罗非鱼亲本保存技术规范 Techniquestandardinholdingtheparentsofhybridbetween niletilapia早andluetilapia 2004-10-01实施 2004-05-31发布 国家质量监督检验检疫总局 发布 中 国国家标准化管委员会国家标准
GB/T19528一2004 前 言 本标准的附录A、附录B和附录C为规范性附录 本标准由农业部提出 本标准由全国水产标准化技术委员会淡水养殖分技术委员会归口 本标准起草单位:水产科学研究院淡水渔业研究中心 本标准主要起草人:吴婷婷、杨弘、李建林
GB/T19528一2004 奥尼罗非鱼亲本保存技术规范 范围 本标准规定了奥尼罗非鱼亲本 奥利亚罗非鱼(Oreochromisaurea)和尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)的来源、纯种鉴别、隔离饲养、提纯复壮和建档管理技术 本标准适用于奥尼罗非鱼亲本的保存 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 NY/T5054无公害食品尼罗罗非鱼养殖技术规范 SC1027尼罗罗非鱼 SC1042奥利亚罗非鱼 SC/T1045奥利亚罗非鱼亲鱼 sC/T1046奥尼罗非鱼制种技术要求 亲本来源 3.1奥利亚罗非鱼来源按SC/T1045的规定执行 3.2尼罗罗非鱼来源按NY/T5054的规定执行 亲本纯种鉴别 4.1形态学鉴别 奥利亚罗非鱼的外部形态特征应符合sc1042的规定;尼罗罗非鱼的外部形态特征应符合sc1027 的规定 4.2细胞遗传学鉴别 奥利亚罗非鱼的染色体数与核型应符合sc1042的规定;尼罗罗非鱼的染色体数与核型应符合 sC1027的规定 4.3生化遗传学鉴别 在血清酯酶的等电聚焦电泳图谱上,奥利亚罗非鱼具有一条等电点为pH4.69的特异性酶带,尼罗 罗非鱼具有一条等电点为pH4.63的特异性酶带 血清酯酶等电聚焦技术见附录A 4.4分子遗传学鉴别 4.4.1酶切线粒体DNA标记技术 用限制性内切酶Pvu酶切在尼罗罗非鱼mtDNA上有3个或4个Pvul位点,奥利亚罗非鱼 mtDNA上有5个Pvul位点 酶切线粒体DNA标记技术见附录B 4.4.2随机扩增多态性DNA技术(简称RAPD技术) 应用RAPD技术筛选出四种引物可检测奥利亚罗非鱼或尼罗罗非鱼 引物OPZ06,奥利亚罗非鱼有一条90obp的片段,在尼罗罗非鱼中没有 引物OPZ10,尼罗罗非鱼有一条150obp的片段,在奥利亚罗非鱼中没有 引物OPZ12,尼罗罗非鱼有一条1700bp的片段,在奥利亚罗非鱼中没有
GB/T19528一2004 引物OPZ19,尼罗罗非鱼有一条730bp的片段,在奥利亚罗非鱼中没有 RAPD标记技术见附录C 隔离饲养 5.1养殖 奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼的苗种、成鱼与越冬期的养殖均按NNY/T5054的规定执行 5.2隔离措施 5.2.1制定隔离保种制度,并严格执行,定期检查 5.2.2纯种繁殖用鱼池和供生产奥尼杂交鱼用鱼池要严格隔离 5.2.3奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼分区专池饲养,各区建立独立的进、排水系统,进、排水口安置过滤 网,严防混杂 5.2.4 不同来源,不同家系,不同世代的奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼要分池隔离倒养,越冬 提纯复壮 6. 选育方法 6.1.1第一次筛选是在苗种培育结束时进行生长优势的个体选择,选留群体数量二总数的2/3 6.1.2第二次筛选是鱼种培育到100g/尾左有的鱼种时,选留符合sc1042和sc1027的规定,表型 优良、生长快的个体 第三次筛选是在后备亲鱼人池越冬时,选留符合sC1042和Sc1027的规定及生长快的个体 6.1.4第四次筛选是在翌年春出越冬池时,严格按照SCc1042、SC1027和sc/T1046的规定进行,并 放人产卵池繁殖 6.2品种提纯 采用混合选择和家系选择相结合的方法 混合选择是从原品种繁殖的后代中,选出符合sc1042、 sC1027和sc/T1046的规定、表型优良的个体,建立5一6个家系,分池饲养,培育成亲鱼 对所建的 每个家系留1000尾(雌800尾,雄200尾)以上的优良个体,进行同代同血缘的同质选配,对后代进行 精心培育,然后在苗种、,100g/尾鱼种时,人池越冬前、春季出池时四个阶段按选育目标进行去劣留优 如此经四个世代筛选,最后选出2~3个优良的家系 6.3复壮 6.3.1选择性状良好,生长快,繁殖力强的不同家系,进行配对繁殖 子代按5.2.3隔离饲养 6.3.2保留1000尾(雌800尾,雄200尾)以上的不同品种、不同家系、不同世代的亲本,以便保持各 自后代群体的杂合性,降低近交系数,防止品种退化 6.3.3进行严格而持续的选择 建档管理 建档 建档的原始资料一般为:引种来源、原名、原来性状、检疫、引进单位、时间,地点、数量、规格、成 活率 7.2育种记录 育种的主要记录如下 -引进种的培育;鱼池面积,水源,水深、水质、放养量、投饵施肥、生长,病害防治及日常管理等 -繁殖配伍、催产、孵化、出苗情况等 苗种培育;品种,面积,水源、水深,水质、放养量、饲养管理,病害防治,选育、,出池、销售等情况 后备亲鱼培育;品种、面积,水源、水深、水质、放养量、饲养管理、病害防治、选育、出池、销售等
GB/T19528一2004 情况 7.3选育记录 选育的主要记录为: D)第一次筛选;鱼苗至鱼种时,选留数量、平均体重(群体平均体重量),表型性状 第二次筛选;鱼种至100g体重时,选留数量、平均体重(群体平均体重量、表型性状 bb 第三次筛选:100g体重至越冬时,选留数量、平均体重(群体平均体重量,表型性状 c d)第四次筛选;越冬至翌年春出池时,选留数量、平均体重(群体平均体重量,表型性状 生产中及时准确记录,定期汇总归档,并接受监督检查 7.4提纯复壮记录 提纯复壮的主要记录为;品种,来源、,家系、世代、性状、育种按7.2记录),选育(按7.3记录)
GB/T19528一2004 附 录 A 规范性附录 血清酯酶等电聚焦技术 血样制备 A.1 白e 从鱼的尾静脉抽取血液0.5mL,室温下放置2h,析出血清,然后以3000r/min,离心15min,放人 -20C冰箱保存 A.2等电聚焦电泳 样品用重燕水稀释5倍,取15L 点样 等电聚焦电泳在5%聚丙烯酰胺凝胶上进行,条件为 pH4一6两性载体电解质,电压1500V,电流25mA,功率20w,电泳2h A.3染色 室温条件下,电泳凝胶在染色液中染色至出现蓝色酶带 溶液配制 A.4 染色液 A.4.1 100 固蓝RR盐 mg 0.5mol/LTris-HCl,pH7.1 10ml 3mL 1%a-}-乙酸禁盼 87 蒸溜水 ml A.4.21%e-,卜乙酸禁酚 乙酸帮盼 1g a- B乙酸莽盼 1g 丙酮 50ml 50mL 蒸僧水
GB/T19528一2004 附 录 规范性附录 酶切线粒体DNA标记技术 B.1线粒体NA的提取 取新鲜罗非鱼肝脏约15g,加5倍体积缓冲液I,用玻璃匀浆器匀浆,匀浆液在3000r/min离心 5min,去除细胞核及碎片 重复上述步骤一次 上清液用12000r/min离心20min,收集沉淀 再重 复上述步骤两次,即得到线粒体 将沉淀充分悬浮于缓冲液I中,加两倍体积溶液I裂解线粒体,冰浴 10min后加1.5倍体积溶液I终止反应 10000r/min离心30min,取上清液用等体积饱和酚抽提两 次,再用苯盼-三氯甲熔-异戊醇(25;24;1)抽提一次,离心后取水相,加两倍体积预冷无水乙醉,在 -20C下过夜 次日在15000r/nmin离心30min,收集线粒体DNA,干燥后溶于适量的缓冲液皿中,加 不含DNA酶的RNA酶,37C水浴1h以分解RNA 再用酚、酚-三氯甲烧-异戊醇抽提蛋白质后,沉 淀、干燥,将所得线粒体DNA溶于灭菌水中,4C保存备用 B.2线粒体DNA的酶解反应 按内切酶生产厂家提供的方法进行线粒体DNA酶解反应 加缓冲液终止反应 B.3琼脂糖凝胶电泳 凝胶浓度为1.2%一1.5%,胶中含0.5只国/mL澳化乙锭,电泳缓冲液为TAE,在室温下电谋,电压 为1v/em,电泳16h 电泳毕在紫外灯下观察拍照 B.4酶解片段大小的计算 以入DNA/EcoRI十Hind川和入DNA/Hlind川完全酶解片段作为分子量标准 根据southern [[1979]的公式计算酶解片段大小 从凝胶上选取三个相邻的分子量标记,其分子量从大到小(或从小到大)依次为L、L.、L.,以碱基 对bp或千碱基对kb计算,其迁移距离分别为mi,ma,m,如一个分子量为L,迁移距离为的待测图 带位于m，和m之间,则 K L 十K B.1 11o 其中 [LLa/L 一LaX一m 1- B.2 n 一[L一LL Lg×mg一m2/mn一mn K B.3 1/(m1一mn. /12 K =L K 1 lo 式中 分子量,单位为碱基对(bp)或千碱基对(kb); -迁移距离,单位为厘米(em) B.5主要试剂配制 缓冲液I;SET-蔗糖缓冲液(100mmol/L氯化钠,.10mmol/LTrieHCl,0.1mmolLEDTA
GB/T19528?2004 250mmol/L,pH7.8) ?I:TE??(50mmol/L,25mmol/LTris-HCI,10mmol/LEEDTA. pH8.0). ?:TE?(10mmol/LTris-HCI,0.1mmol/LEDTA,pH7.5) ??????(10mmol/L.Tris-HCI,0.lmmol/LEDTA,pH7.5) ?I;SDS?(1%SDS,0.2mol/LNaOH) ?I;3nmol1?(pH4.8,K*?3nmol/L..?5molL. TAE??:0.04mol/LTris-,0.002mol/1EDTA
GB/T19528一2004 附 录 C 规范性附录 RAPD标记技术 C.1罗非鱼DNA的制备 用浸有ACD抗凝剂的针筒从鱼尾静脉抽血0.5mL1mL,将血样放在4C中静置30min,使血细 胞下沉 吸取血细胞30L,加人470ALSET缓冲液中,再加人10mg/mL 的蛋白酶K,混匀后加人 12.5l20%SDS溶液,轻轻混匀后置于55C水浴消化过夜 次日将消化液用等体积的饱和酚、盼-三 氯甲烧-异戊醇的(25:21:1)和三氯甲烧-异戊醇(24:1)各抽提一次 弃去下层有机相,向水相中加 人两倍体积一20C预冷的无水乙醉沉淀DNA 将DNA沉淀清洗、干燥,溶于适量的TE(pH7.4)缓冲 液中 用紫外分光光度计测量DNA样品的浓度和纯度,再稀释至10ng/L,置于4C保存备用 c.2RAPD扩增反应 扩增体系共25l,含有50mmol/L氯化钾,10mmol/LTris-HC,2.0mmol/儿氯化镁,0.1% TritionX-100,dATP,dCTP,dGTP,dTTP各0.2mmol/L,15ng随机引物,20ng模板DNA,1.5单 位TagDNA聚合酶,灭菌重蒸水 RAPD反应条件;94C下预变性2min一5min,再进人循环,94C变性1min,36C退火1min,72c 延伸2 ,经过35一45个循环后,再在72c下延伸10min min， C.3 电泳检测 扩增产物取出后,加人十分之一体积的10×BPB上样缓冲液混匀,在1.4%含0.54g/mL，澳化乙 锭的琼脂糖凝胶中电泳 DNA扩增条带的分子量测定与附录B相同