GB/T19180-2020
牛海绵状脑病诊断技术
Diagnostictechniquesforbovinespongiformencephalopathy
- 中国标准分类号（CCS）B41
- 国际标准分类号（ICS）11.220
- 实施日期2020-12-14
- 文件格式PDF
- 文本页数18页
- 文件大小1.22M
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牛海绵状脑病诊断技术
国家标准 GB/T19180一2020 代替GB/T191802003 牛海绵状脑病诊断技术 Diugostictechmiquesforbovimespongiformeeephalopathy 2020-12-14发布 2020-12-14实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标涯花管理委员会国家标准
GB/T19180一2020 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准代替GB/T191802003《牛海绵状脑病诊断技术》
本标准与G;B/T19180-2003相比,除 编辑性修改外,主要技术变化如下 -增补了H
E组织病理染色法、免疫组织化学方法和免疫印迹方法的适用范围,删除了“也可 用于其他动物的传染性海绵状脑病的诊断”见第1章); -优化了临床症状的描述(见4.3); 优化了HE组织病理染色法操作步骤(见5.1)和免疫组织化学方法操作步骤(见5.2); 增补了免疫印迹方法(见5.,3) 本标准由农业农村部提出.
本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口
本标准起草单位动物卫生与流行病学中心 本标准主要起草人;王志亮、刘雨田,孙成友.迟田英,宋芳芳、邹艳丽、于小静,吴晓东,王树双 本标准所代替标准的历次版本发布情况为 GB/T191802003
GB/T19180一2020 引 言 牛海绵状脑病(IBovineSpongiformEncephalopathy，BSE)是由肮病毒引起的牛的一种慢性致死性 神经性疾病,对动物和人构成较大危害
世界动物卫生组织(OIE)将其列为严重影响国际贸易的动物 疫病之一,我国将其归为一类动物疫病
我国现行《牛海绵状脑病诊断技术>(GB/T191802003)系 2003年6月4日由原国家质量监督检验检疫总局发布,2003年12月1日起实施
该标准仅包括临床 症状、组织病理学、免疫组织化学等三种诊断方法,未包括OIE陆生动物手册指定的另一种确诊方法即 免疫印迹
免疫印迹方法比免疫组织化学方法更灵敏,特异性更好
因此,免疫印迹方法是牛海绵状脑 病诊断技术中一种更好的确诊方法它能更好地服务于我国疯牛病的监测工作 BSE分为典型BSE和非典型BSE
典型BSE是由于牛采食污染牛羊肮病毒的肉骨粉或者饲料而 引起,非典型BSE为自然发生的一种散发性BSE
自然条件下,BSE经由消化道传播,未发现水平和垂 直传播的证据
典型BSE的潜伏期一般为2年8年,平均为4年5年,多发于46岁的牛,2岁以 下罕见,6岁以上明显减少
根据病原的分子量大小,非典型BSE又分为H型和L型
非典型BSE的 平均发病年龄为11岁
BSE病程多为数月至一年,最终死亡 大多数BSE病牛无典型临床症状,因此BSE的诊断应通过实验室检测来实现
BSE的病原是动 物机体内肮蛋白的异构体,在病牛血清里检测不到SE阮病毒抗体,所以血清学检测方法对于BSE来 说是无意义的
目前,实验室诊断方法多以检测BSE病原为目的,包括免疫组织化学方法、免疫印迹方 法、,ELIsA方法等,其中免疫组织化学方法和免疫印迹方法是oIE手册规定的BSE确诊方法
BSE病 牛的中枢神经被阮病毒侵害会出现海绵状空泡变性,在中枢神经保存良好且未发生自溶的情况下,应用 HE组织病理染色法可以观察到这些病变情况
oIE手册规定HE组织病理染色法是确诊SE 的辅助方法,在使用免疫组织化学方法诊断SE时应同时使用HE组织病理染色法予以辅助确诊 在使用免疫印迹方法诊断BSE时,如果样品适合进行HE组织病理染色,那么也应同时使用H 组织病理染色法予以辅助确诊
GB/T19180一2020 牛海绵状脑病诊断技术 范围 本标准规定了BSE诊断的临床诊断、实验室诊断及综合判定技术要求
本标准适用于BSE的诊断,其中临床诊断适用于BSE的监测和流行病学调查,H
E组织病理染 色法适用于BSE中枢神经系统的病理诊断,免疫组织化学方法和免疫印迹方法适用于BSE的病原学 诊断
缩略语 下列缩略语适用于本文件
BSE;牛海绵状脑病(BovineSpongiformEncephalopathy) HE:苏木精伊红(Hematoxylinandeosin) HRP;辣根过氧化物酶(Horseradishperoxidase PBS;磷酸盐缓冲溶液(Phosphatebufferedsolution) PK酶;蛋白酶K(ProteinaseK PVDF:聚偏氟乙烯(Polyvinylidenefluoride SDS:十二婉基硫酸钠(Sodiumdodecylsulfate) TBST;等渗缓冲盐溶液(Tris-HclbuferedsolutionwithTween) 临床诊断 3.1易感动物 牛科和猫科动物,包括各种牛、各种羊和各种猫科动物
3.2临床症状 3.2.1行为异常 表现为不安,恐惧、异常震惊或沉郁;不自主运动,如磨牙、震颤;不愿经过有缝隙的地面或进人畜 栏等
3.2.2感觉或反应过敏 表现为视、听,触三觉过于敏感，对光线的明暗变化、外部声响以及颈部触摸过度敏感,这是BsE 病牛的特征性临床表现
3.2.3运动异常 病牛步态呈“鹅步”状,共济失调,四肢伸展过度,有时倒地难以站立
3.2.4体重和体况下降 病牛的体重和体况下降,表现出异常消瘦,体质虚弱
GB/T19180一2020 3.3病理变化 剖检无明显病变 3.4结果判定 易感动物出现上述临床症状,又不能确定为其他疾病时,可判定为疑似BSE
确诊应采集易感动物的脑组织进行实验室诊断
实验室诊断 4.1E组织病理染色法 4.1.1实验室生物安全要求 实验操作应在生物安全级以上的实验室进行
涉及有毒挥发性试剂的操作应在通风橱中进行， 如甲醛、甲酸,二甲苯、氯仿等
4.1.2仪器设备 显微镜、切片机、电锯/钢锯、骨钳、眼科剪、直形慑(长约25cm)、手术刀,切片刀、烘烤箱、脱水筐、 染色缸、包埋模具、载玻片、盖玻片,玻璃棒,染色架、量筒量程分别为100mL、1000mL、5000mL)、 通风橱
4.1.3试剂 4.1.3.1蒸僧水
4.1.3.210%中性福尔马林固定液(见附录A中A.1. 4.1.3.3无水乙醉
4.1.3.4二甲苯
4.1.3.5氯仿
4.13.6软蜡(熔点56 4.13.7硬蜡熔点60C) 4.1.3.8苏木素染液(H
E染液,见A.2). 4.1.3.91%盐酸酒精(见A.3). 4.1.3.10饱和碳酸锂水溶液(见A.4)
4.1.3.11 95%酒精伊红溶液(见A.5 4.1.3.12中性树胶
4.1.3.13无机试剂原料均为分析纯
4.1.4采样 将牛头固定,用电锯从前额两牛角根部向枕骨大孔背侧缘方向锯开,使脑部暴露
剪开脑膜并切断 所有与脑部相连的神经和血管,取出整脑,包括大脑、小脑和完整脑干
大规模监测采样时,可用专用采 样勺国家牛海绵状脑病参考实验室提供)从枕骨大孔处取出延脑部组织即可
采样勺取样时,先上下 左右四个方向剪开脑硬膜,再用戴一次性乳胶手套的手指绕延脑转一转以切断脑神经和血管,然后紧贴 颅腔壁插人采样勺,插人深度约5cm~7 7cm
用力将采样勺的手柄往上翘,再往下切断脑组织,然后左 右切断脑组织,最后将切下的脑组织往外抠出
GB/T19180一2020 4.1.5固定 将所有组织直接放人10倍体积的10%中性福尔马林固定液中渗透固定96h,换新配制的固定液 再固定48h. 4.1.6组织切片制作 4.1.6.1取材 把大脑,小脑、脑干组织分离开,分别横切成3mm5mm厚的组织块,选取以下部位组织做进 步处理,包括大脑、小脑、脑桥、丘脑、四叠体,脑门,延髓
适当修剪这七块用于检测的组织边角以适用 脱水筐大小,剩余组织继续固定以备用
用脱水筐装好检测用的组织块,并用铅笔做好标记,盖好脱水 筐盖
投人新配制的10倍体积的固定液再固定72h
4.1.6.2甲酸处理 将装有组织块的脱水筐移人98%甲酸中作用1h,自来水冲洗20nmin,然后再移人新配制固定液中 处理3h
4.1.6.3脱甲醛 将装有组织块的脱水筐放人染色缸中,用缓慢流动的自来水漂洗24h
4.1.6.4脱水 将装有组织块的脱水筐放人染色缸中,依次在以下梯度酒精中分别脱水: 75%酒精浸泡2h
aa b 85%酒精浸泡2h. 95%酒精I浸泡2h
c d 95%酒精I浸泡2h e 00%酒精I浸泡2h. D 00%酒精浸泡2h. 4.1.6.5透明 4.1.6.5.1氯仿I浸泡2.5h或者二甲苯I浸泡40min 4.1.6.5.2氯仿l浸泡3h或者二甲苯l浸泡30min
4.1.6.6浸蜡 依次在以下石蜡中浸蜡,温度为60C 软蜡I浸泡40min
a b软蜡浸泡1h
硬蜡浸泡1h
c 4.1.6.7 包埋 4.1.6.7.1若包埋模具为金属条结构的,则先组装好包埋模具,放置在光滑平整的金属台面上,再将熔 化的新硬蜡倒人包埋模具里,直至倒满,然后将浸好蜡的组织块放人其中(待切片的一面朝下,并放平 整)
如果一个模具里可以放置多个组织,则两个组织之间距离应大于1.5cm
冷却过夜,用切片刀修
GB/T19180一2020 切成形,获得平整的石蜡组织块,然后给每个组织块贴上标签
4.1.6.7.2如果包埋模具为凹型的用于单个组织包埋的模具常见包埋机所用模具),则先将模具加热 至70C,放置在同样温度的金属台面上,然后滴满熔化的新硬蜡,再将浸好蜡的组织块放人其中(待切 片的一面朝下,并放平整),用去除盖子的脱水筐(尺寸与包埋模具匹配)放于其上,最后将整个包埋模具 包括组织等)平移至冷台上
待冷却好后,将脱水筐从包埋模具中取出,获得平整的石蜡组织块,然后 给每个组织块贴上标签
4.1.6.8切片 将石蜡组织块切成54m厚的组织薄片
每块组织连续切片3片10片,切片刀、,碎屑和废弃组织 应焚烧处理
组织薄片用干净的粘附剂预处理过的载玻片贴片(组织应贴在磨砂面/标记面的同侧,以 便给玻片做标记),然后用铅笔在载玻片上做好标记
4.1.6.9烤片 贴好组织薄片的载玻片先在自然条件下晾干,然后放人烘烤箱中50C烘烤4h以上 4.1.7组织染色 4.1.7.1 脱蜡和脱二甲苯 取烘烤好的玻片整齐放人染色架上,依次在以下试剂中脱蜡和脱二甲苯 二甲苯I10min a b 二甲苯I101 min
e 00%酒精I2 min d 100%酒精I2 min 95%酒精I2min. e fD 95%酒精2min. 85%酒精2min. 日 75%酒精2min
h 自来水洗2min
4.1.7.2HE染色 4.1.7.2.1苏木素染液15min 4.1.7.2.2自来水漂洗2nmin 4.1.7.2.31%盐酸酒精10s
自来水漂洗5min. 饱和碳酸锂水溶液30s
4.1.7.2.6自来水漂洗10min
75%酒精2min
4.1.7.2.885%酒精2 mln 4.1.7.2.995%酒精伊红液1min
4.1.7.3脱水和透明 4.1.7.3.1 95%酒精2 min
4.1.7.3.2100%酒精I2min
GB/T19180一2020 4.1.7.3.3100%酒精I2min 4.1.7.3.4二甲苯I2min 4.1.7.3.5二甲苯2min
4.1.7.4封片 用干净玻璃棒取一滴中性树胶,滴加在玻片的组织上,再用干净的盖玻片进行封片,放置在平整的 台面上使其自然干燥
4.1.7.5镜检及判定 4.1.7.5.1分别在倍数为10×10、,10×20和10×40的光学显微镜下观察切片
4.1.7.5.2阳性结果
灰质区出现空泡变性,特别是神经纤维网浆和神经细胞内有规则的圆形或卵圆 形空泡,空泡内不着色或被伊红淡染,界限明显,胞核被挤压于一侧,甚至消失;有的神经细胞被单个或 多个特异性空泡胀大,成为"气球样"空泡性神经细胞
容易出现空泡病变的部位是中脑和延酷的核群 且呈双侧对称性分布
阴性结果
灰质区无特征性空泡变性
4.1.7.5.3 在正常情况下,动眼神经核和红核处的核周质也可能有少量空泡出现,但不呈双侧对称,应 4.1.7.5.4 注意区别
若在脑干灰质区未发现双侧对称性海绵状空泡病变,则用免疫组织化学方法做进一步诊断
组织病理学诊断只是疯牛病确诊的辅助方法,确诊时应结合免疫组织化学或免疫印迹诊断方法
4.2免疫组织化学方法 4.2.1实验室生物安全要求 见4.1.1 4.2.2仪器设备 见4.1.2
另外,还需要高压锅温度能达到134C),水浴锅、恒温箱、冰箱(含冷冻和冷藏、电磁 炉,金属锅(烧水用)、陶瓷锅(直径不少于18cm),湿盒(在玻片盒的底部铺上湿的吸水纸便成了湿盒) 微量移液器(量程分别为0.5l10A5l一50AL,10l100A、50l200AL,1001000L. 4.2.3试剂 4.2.3.1燕馏水
4.2.3.210%中性福尔马林固定液(见A.1)
4.2.3.3无水乙醉 4.2.3.4二甲苯
42.3.5氯仿
4.2.3.6软蜡(熔点56C). 4.2.3.7硬蜡(熔点60C. 4.2.3.8蛋白酶K缓冲液(见附录B中B.l).
4.2.3.9蛋白酶K工作液(见B.2). 4.2.3.10高压缓冲液(见B.3)
4.2.3.113%双氧水-甲醉(见B.4,如果免疫组织化学显色试剂盒中带有类似的试剂,则使用试剂盒中 的试剂. 4.2.3.120.1mol/IPBS(见B,5)
GB/T19180一2020 4.2.3.135%正常猪血清(见B.6,如果免疫组织化学显色试剂盒中带有类似的试剂,则使用试剂盒中 的试剂,但不得使用反刍动物源性血清). 4.2.3.14Ma layer氏苏木素液(商品化产品 4.2.3.15水溶性封片剂(商品化产品)
4.2.3.16二步法免疫组织化学显色试剂盒(商品化产品,其中二抗应为抗鼠二抗)
4.2.3.17 -抗(商品化产品)工作液(见B.7)
4.2.3.18无机试剂原料均为分析纯
4.2.4采样 见4.1.4
4.2.5固定 见4.l.5
4.2.6组织切片制作 见4.1.6
免疫组织化学操作步骤 4.2.7 设置对照
免疫组织化学诊断应设置疯牛病阳性和阴性对照组织切片
4.2.7.1 4.2.7.2脱蜡和脱二甲苯
取烘烤好的玻片和对照切片整齐放人染色架上,依次在以下试剂中脱蜡和 脱二甲苯 二甲苯I10min a b 二甲苯I10min 100%酒精I2nmin c d 100%酒精l2nmin 95%酒精I2min. e 95%酒精I2min 85%酒精2min
日 75"%酒精2min
h 自来水洗2min
4.2.7.3从自来水中取出装有玻片的染色架,在PBS中洗5min×3次
在洗第一次PBS的同时,配制 适量的蛋白酶K缓冲液,并放人水浴锅中预热37C
另外,取出冷冻的蛋白酶K母液使其化冻,以 待用
4.2.7.4在最后一次PBS漂洗时,配制好蛋白酶K工作液
PBS洗完后,立即将玻片放人装有蛋白酶 工作液的染色缸中,并确保玻片全部浸人液体,在37C水浴中消化处理15min
与此同时,准备好 煮沸的燕僧水,并配制好高压缓冲液
4.2.7.5将高压缓冲液倒人陶瓷锅,并立即将玻片放人其中,确保玻片完全浸人水中,盖好盒盖,在 121C(约103kPa)高压处理20min,自然冷却至60C以下取出
4.2.7.6在PBS中洗5min×3次,洗最后一遍时配制好3%双氧水甲醇溶液 4.2.7.7将玻片完全浸人3%双氧水甲醇溶液中室温处理5min. 4.2.7.8在PBS中洗5min×3次
如果正常猪血清是冷冻的,则需要提前取出化冻,用前5min配 制好
4.2.7.9在玻片的组织上滴满5%正常猪血清,置湿盒中轻轻盖上盖子,室温作用20min
同时,取出
GB/T19180一2020 冷冻的一抗进行化冻,并配制好工作液
4.2.7.10弃去正常猪血清,用吸水纸吸干组织四周的液体
4.2.7.11将一抗工作液滴加在组织上,确保组织完全覆盖,湿盒中37C作用4h,或者在2C8C下 作用过夜
4.2.7.12在PBS中洗5min×3次,同时取出2C8C下保存的免疫组织化学显色试剂盒,使其回温 至室温状态
4.2.7.13洗完后用吸水纸吸干组织四周的液体,然后在组织上滴满显色试剂盒中的标记聚合物-HRP 的抗鼠二抗,湿盒中室温作用30min
4.2.7.14在PBS中洗5min×3次
4.2.7.15洗完后用吸水纸吸干组织四周的液体,然后在组织上滴满试剂盒中的底物显色液,确保组织 完全覆盖,湿盒中室温作用5min10nmin 4.2.7.16在燕僧水中漂洗3nmin×3次
4.2.7.17将玻片放人Mayer氏苏木素液复染作用1min. 4.2.7.18在蒸僧水中漂洗5nmin 用水溶性封片剂封片 4.2.7.19 4.2.8结果判定 4.2.8.1在阳性和阴性对照片染色结果正确的情况下,分别在倍数为10×10、10×20和10×40的光学 显微镜下观察组织玻片,进行结果判定
4.2.8.2阳性结果:脑组织灰质区特别是脑门部的迷走神经背核,孤束核和三叉神经脊束核等处出现特 异性颗粒状染色,则判定为疯牛病阳性
4.2.8.3阴性结果;脑组织灰质区未见特异性颗粒状染色,则判定为疯牛病阴性
4.3免疫印迹方法 4.3.1实验室生物安全要求 见4.1.1,但组织匀浆、消化及变性时需在负压罩下操作
4.3.2仪器设备 电泳仪、半干转印仪、组织匀浆机、化学发光成像仪、冰箱含冷冻和冷藏、温箱能恒定在37C)、 金属浴、摇床,电子天平、平m(直径为12erm15em),玻璃棒,眼科剪,眼科银、保鲜膜,玻璃板(大小约 20em×20cm)、专用铲刀(用于撬开预制胶),塑料桶、微量移液器(量程分别为0.54L~10AL、5l 50l,10l100AL、,50l一200l,100l1000AL)
4.3.3试剂 蒸僧水
4.3.3.1 10道泳道的12%sDsNuPage胶(又称预制胶,商品化产品) 4.3.3.2 4.3.3.3预染蛋白质Marker(商品化产品,应含有15kDa一35kDa之间的蛋白条带). 4.3.3.4匀浆缓冲液(见附录C中C.1). 4.3.3.5蛋白酶K溶液(见C.2)
4.3.3.6消化阻止液(见C.3)
4.3.3.7 上样缓冲液(见C.4) 4.3.3.8电泳缓冲液(商品化产品,与12%SDSNuPage匹配)
GB/T19180一2020 4.3.3.9甲醇
4.3.3.10TBST(见C.5)
4.3.3.11转印缓冲液(见C.6)
4.3.3.12封闭液(见C.7).
4.3.3.13PVDF膜
4.3.3.143MM滤纸 4.3.3.15一抗(商品化产品)工作液(见c.8)
4.3.3.16标记HRP的兔抗鼠lgG(商品化产品工作液(见C.9).
4.3.3.17化学发光显色试剂盒(商品化产品. 4.3.3.18阳性对照(见C.10)
4.3.3.19阴性对照(见C.11). 4.3.3.20无机试剂原料均为分析纯
43.4采样 通过枕骨大孔采集脑门部组织,并于-15C-20冷冻保存待用
4.3.5实验操作步骤 4.3.5.1样品处理 取100mg130g脑门部组织放人1.5mL的专用匀浆管中,加人1.2ml匀浆缓冲液
用匀浆 机以6200r/min的速度匀浆45sec
将匀浆好的样品吸取到1.5mL离心管中,以7000尽离心5nmin， 然后将上清移至另一离心管中
4.3.5.2PK酶消化 取50L离心好的样品、阳性对照、阴性对照分别移至1.5ml离心管中,各加人5L蛋白酶K溶 液,使蛋白酶K终浓度达到504g/mL以上,混匀后放在48C金属浴中消化40min
为防止消化过程 中离心管盖被热气体撑开,可以加一重物如铁块压住盖子
消化完后各加人3aL消化阻止液阻止蛋白 水解反应
4.3.5.3蛋白变性 在消化完的样品阳性对照、阴性对照中分别加人50AL上样缓冲液,混匀后置96C金属浴中变性 5min
4.3.5.4电泳 4.3.5.4.1将预制胶安放好,在电泳槽内槽加满电泳缓冲液的工作液(不要溢出),外槽加至浸没过胶底 端1/3处和电泳槽中的导热丝总共需要约400ml电泳缓冲液)
如果电泳仪与预制胶不匹配,则可 以自行配制12%sDSPage胶,配方及操作可参见相关资料
43.5.4.2两端平行地拔出梳子,在第一道泳道加人10L蛋白质Marker,第二道泳道加人12L阳性 对照,第三道泳道加人12L阴性对照,在其余泳道加人12AL变性完的样品(样品要趁热加)
安装好 电泳装置,接通电源,设定电压200V,时间40min进行电泳
同时,配制好转印缓冲液,放2C一8C 预冷
4.3.5.5电转印 4.3.5.5.1电泳完后,取出预制胶
用专用铲刀从四周撬开预制胶外壳,切掉胶的加样齿孔及胶底部染
GB/T19180一2020 液线以下部分
在胶上倒一点转印缓冲液,使胶保持湿润
然后按照胶的大小,剪好PVDF膜及4张 滤纸,PVDF膜应比滤纸稍大
将PVDF膜放人100%甲醉中浸湿1min,之后将滤纸和膜放人转印缓 冲液中浸泡平衡15nmin
4.3.5.5.2在玻璃板上先放置两层对齐的滤纸,用玻璃棒沿一个方向轻赶气泡用铲刀将胶取出放于滤 纸上,并与逃纸对齐
夹取另两张逃纸,滴一些转印液在胶上,并使胶全部浸醒,然后将浸好的膜从一蹦 慢慢往另一端放下,直至完全覆盖在胶上
如果发现膜与胶之间有白点,说明它们之间存在气泡,则用 玻璃棒滚动将其驱赶
如果气泡太多,则取下膜,在转印液中再次浸湿,重新放置于胶上
如此反复,直 至没有气泡
然后,将取出另两层滤纸整齐放于膜上,用玻璃棒驱赶气泡
“三明治”做好后,用铲刀将 其转人转印槽中,注意膜的一端朝向正极
往“三明治”上倒人少量转印缓冲液,再用玻璃棒轻赶气泡 4.3.5.5.3盖上盖子,接通电源,设定电压15V,时间15min进行转印 4.3.5.6封闭 转印结束后,弃去胶和滤纸
观察Marker转印效率,如果膜上有清晰的Marker条带,说明转印效 率良好,否则转印失败
将膜放人装有封闭液的平皿中,确保膜完全(至少有蛋白的区域)浸没，4C作 用过夜或者37C作用1h
注意与胶接触的一面朝上,以后的步骤都是这样
封闭结束,置摇床上用 TBST摇洗3次,每次5min. 4.3.5.7一抗作用 将膜放人一抗工作液中,确保膜完全浸没,室温下置摇床摇振孵育1.5h
作用完后,置摇床上用 TBST摇洗6次,每次5min
4.3.5.8二抗作用 将膜放人标记HRP的免抗鼠lgG工作液中,确保膜完全浸没,室温下置摇床摇振孵育1h
孵育 40min后,打开化学发光成像仪进行预热
孵育完后,置摇床上用TBST摇洗6次,每次5min
4.3.5.9底物作用 按照化学发光显色试剂盒说明书配制好化学发光底物溶液(至少5mL),混合均匀
将膜放置在一 干净平皿中,将底物溶液滴加到膜的表面上,作用10min. 4.3.5.10化学发光 按照5倍于膜的大小剪一块保鲜膜,并将其展平放于桌上
底物作用完后,将膜取出
再将膜平放 在保鲜膜中间位置,拿起保鲜膜的一边,沿PVDF膜的一边折起,覆盖在PVDF膜上,再将周边的保鲜 膜稍微折叠,即可放人化学发光成像仪中或通过X光胶片曝光
一般情况曝光2min一3min即可
若 条带太浅,则需要增加曝光时间;相反,则应减少曝光时间,直至效果最佳
注意,每次都要以图片格式 保存好照片,以便判定结果
4.3.6结果判定 4.3.6.1在阳性对照和阴性对照均成立的条件下,才可判定其余样品的结果
4.3.6.2阳性结果;曝光照片上的样品泳道出现三条特异性黑色条带,且对比胶上的蛋白质Marker分 析条带大小在17ku一33ku之间,则判定为疯牛病阳性
4.3.6.3阴性结果:曝光照片上的样品泳道没有特异性黑色条带,或者有个别杂条带,但对比胶上的蛋 白质Marker分析条带大小不在17ku33ku之间,则判定为疯牛病阴性
GB/T19180一2020 5 综合判定 5.1临床无明显特征性症状或判定为疑似的易感动物,经4.2(免疫组织化学方法)或者4.3(免疫印迹 方法)检测出牛海绵状脑病病原,则可判定为感染牛海绵状脑病
5.2免疫组织化学方法诊断BSE时应同时使用H
E组织病理染色法予以辅助确诊
5.3免疫印迹方法诊断BSE时,如果样品适合进行H
E组织病理染色,那么也应同时使用HE组 织病理染色法予以辅助确诊 0
GB/T19180一2020 录 附 A 规范性附录 HE组织病理染色法试剂配制 A.110%中性福尔马林固定液 A.1.1配方 氯化钠 8.5g 蒸水 900tmL 甲醛 100ml A.1.2配法 把以上材料混匀溶解即可使用
A.2苏木素染色液 A.2.1配方 1.0g 苏木精 10 无水乙醇 ml 200mL 蒸憎水 0.5 氧化汞 g 8ml 冰乙酸 20.0g" 钾明研 A.2.2配法 先将苏木精溶于无水乙醇,然后将钾明矶和蒸憎水煮沸溶化去火并迅速加人苏木精无水乙醉溶液 中,立即加人氧化汞并煮沸,迅速冷却后加人冰乙酸,过滤后使用
A.31%盐酸酒精 在10mL.的70%或80%酒精中加人！ ml的浓盐酸
A.4饱和碳酸锂水溶液 碳酸锂2g加100mL蒸憎水,充分溶解
A.595%酒精伊红溶液 伊红0.5g加人100mL95%酒精中溶解
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GB/T19180?2020 ? 淶??) ??? B.1 ?K? ???(1mol/LpH8.0) 2.5ml 0.75ml ?(0.1mol/L ? 50ml B.2?K? ???K?м17L?K??(?,??l4.7mg/ml),?乤 ??5g/mL B.3?? 123ml 0.1mol/ 0.1mol/ 27mL 1350mL е?? ?,??,?0.1mol/?0.1mol/L?ɡ B,43%??????5min ? 50ml 1.5mL ??(30% B.50.1mol/L.PBs(p7.4) 88 ? g ? 0.2g 1.44g 0.24g ?800mL?,?pH?7.4,?1L B.65%? 0.1mol/LPBs(pH7.4 4ml ? 200l B.7 -? -?????,0.1nmol/LPBs(pH7.4)??,?乤?? 5g/mL 12
GB/T19180一2020 录 附 C 规范性附录 免疫印迹方法试剂配制 匀浆缓冲液 C.1 盐酸三羚甲基氨基甲炕(pH7.5) 100ml 氯化钠 0.88g TritonX-100 0.5ml 0.5g 脱氧胆酸钠 0.29 乙二胺四乙酸 g 充分溶解混匀即可使用,溶解不充分时可加热
可在4下保存数周
C.2蛋白酶K溶液 10mL 盐酸三胫甲基氨基甲婉(pH8,.0 1l.1 氯化钙 mg 蛋白酶K 6nmg C.3 消化阻止液 174mg苯甲基碱酷氧,溶于10mL异丙醉,使其浓度为100mmol/L
使用时的工作浓度约为 mmol/L
配好后应分装保存在一20C 5 或者用市场上其他的PK酶阻止液,按照说明书配制使用即可
C.45×上样缓冲液 0mL的配方 lmol/L盐酸三羚甲基氨基甲婉(pH6.8) 0,6ml 50%甘油 5ml 0%sDs 2ml 2-疏基乙醇 0,5ml 1%溴酚蓝 1nmL 蒸水 0.9ml 使用时取1份5×上样缓冲液,加燕水4份,并充分混匀
可在4C下保存数周
c.5TBST 氯化钠 8g 氯化钾 0.2g 三胫甲基氨基甲婉 3g 13
GB/T19180一2020 加蒸僧水至800mL溶解,加浓盐酸调pH值至7.4(大约需要1.9mL浓盐酸),后加燕憎水定容至 1 000mL ,最后加人500LTween-20 c.6转印缓冲液 3.028 三胫甲基氨基甲炖 g 14.413 甘氨酸 g 加蒸僧水溶解至900ml,再加100mL100%甲醇,用前放置28C预冷 C.7 封闭液 2g 牛血清白蛋白 TBST 100ml 充分溶解即可使用
C.8一抗工作液 -抗为商品化的鼠抗牛肮蛋白单克隆抗体(也能与痒病病原结合),用含1%牛血清白蛋白的 TBST溶液稀释单抗,使其工作浓度达到54g/mL
标记HRP的兔抗鼠IgG工作液 C.9 用含1%牛血清白蛋白的TBST溶液稀释抗体,使其工作浓度达到54g/mL c.10阳性对照 取免疫组化方法验证为痒病阳性的脑门部组织100mg,按照4.3.5.1的要求进行匀浆、离心处理 并以每管504L分装于1.5mL离心管中,一20C冷冻保存待用
制作过程中的生物安全要求见4.3.1 规定
C.11阴性对照 取免疫组化方法验证为痒病阴性的脑门部组织100nmg,按照4.3.5.1的要求进行匀浆、离心处理 并以每管50AL分装于1.5mL离心管中,一20C冷冻保存待用
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GB/T19180一2020 考文 参 献 [1]世界动物卫生组织陆生动物诊断试验和疫苗手册， [[2]英国OIE疯牛病参考实验室BSE诊断手册
牛海绵状脑病诊断技术GB/T19180-2020介绍
牛海绵状脑病（Bovine Spongiform Encephalopathy，BSE），又称“疯牛病”，是一种由异常蛋白质PrP（Prion Protein）引起的神经系统退化性疾病。该病最早在20世纪80年代在英国爆发，随后在欧洲多个国家和地区发生过疫情。牛海绵状脑病的传染性、潜伏期长、致死率高，给养殖业和人类健康带来了极大的威胁。
为规范牛海绵状脑病的诊断技术，在中国标准化协会的指导下，制定了GB/T19180-2020《动物源性食品中牛海绵状脑病诊断技术》标准，该标准于2020年2月1日起生效。
GB/T19180-2020标准主要涉及牛海绵状脑病的诊断方法、样品采集和处理、实验室安全等方面。标准规范了样品的采集、保存和运输等具体操作步骤，确保诊断结果可靠、准确。同时，标准也对实验室的建设、人员培训和实验室管理等方面进行了详细的规定，以保障实验室安全和质量控制。
根据GB/T19180-2020标准，牛海绵状脑病的诊断可以通过多种方法来进行，包括组织学检查、免疫组化、Western blot分析、核酸检测等。这些方法在诊断过程中各有优缺点，需要根据具体情况进行选择使用。
总之，GB/T19180-2020标准的制定为牛海绵状脑病的预防和控制提供了有力的技术支持，也为相关行业和实验室提供了标准化的操作流程和安全管理模式。
