花生黑腐病菌检疫鉴定方法

国家标准 GB/T36821一2018 花生黑腐病菌检疫鉴定方法 DeteetionandidentifieationofCaloneetriailicieolaBoedjn&Reitsma 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 币国国家标准化管理委员会国家标准
GB/36821一2018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口 本标准起草单位:烟台出人境检验检疫局、山东出人境检验检疫 局、威海出人境检验检疫局、珠海出人境检验检疫局 本标准主要起草人:李金庆、张京宣、鲁闽,粟智平、王颖、段效辉、李春喜、王简、张卫东、昌文诚、 刘鹏
GB/36821一2018 花生黑腐病菌检疫鉴定方法 范围 本标准规定了花生黑腐病菌(CalonectriailieicolaBoedijn& Reitsma)的检疫鉴定方法 本标准适用于花生、大豆等寄主植物及植物产品、土壤等传带的花生黑腐病菌的检疫鉴定 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 SN/T2122一2015进出境植物及植物产品检疫抽样方法 花生黑腐病菌基本信息及分类地位 病害英文名Blackrotofpeanut,Redcrownrotofsoybean 有性阶段学名;CaloeriailieieolaBoedijn&Reitsma,异名CaloneectriacerotalariaeL.oos) Bell&.Sobers Calonectriailicicola隶属于子囊菌门(Ascomycota),子囊菌纲Ascommycetes),粪壳菌亚纲Sor- dariomycetidae),肉座菌目Hypocreales),丛赤壳科(Nectriacea),丽赤壳属Caloectria 无性阶段中文名:花生黑腐病菌,寄生帚梗柱抱霉,寄生柱枝袍 无性阶段学名: Cylindrocladiunnparasiticumn Crous，Wingfield Alfenas，异名 Cylindrocladiumcrotalariae(Loos)Bell Sobers 隶属于有丝分裂抱子真菌类(Mitosporicfungi),丝抱纲(Hyphomy Cylinndrocladi4arasiticum etes),丝袍目(Hyphomycetales),丝袍科(HHyphomycetaceae),帚梗柱袍属(Cylindrocladium) 花生黑腐病是典型的土壤传播和种子传播病害,具有危害严重、传播迅速和较难防治的特点 该病 病原菌广泛分布于土壤中,除能为害花生,大豆等豆科植物外,还能引起茶树,油加利树等植物的叶斑 病 病菌先侵染子叶使其变黑腐烂,继而侵染幼苗根茎部 潮湿环境下,病部长出许多霉状物覆盖茎基 部,茎叶失水萎蔫死亡 在田间常与花生新赤壳基腐病相混淆(表A.1) 花生黑腐病菌在10C 30C范围内均能生长,最适生长温度为25C一28C 病菌在世界上的分布,寄主植物、发病症状及与 近似病害的比较等其他信息参见附录A 方法原理 依据花生黑腐病菌在寄主上的症状、形态学特征和PCR特异性扩增等进行检测鉴定
GB/T36821一2018 5 主要仪器设备 5.1仪器设备 5.1.1生物显微镜;放大倍数40×1000× 5.1.2体视显微镜;放大倍数1.95×250× 5.1.3生物安全柜:符合EN12469:2000标准 5.1.4高压灭菌器;灭菌工作温度105C138 5.1.5光照生物培养箱:温范围0C50C,温度波动度士0.5,温度均匀度士1C,光照度0lx一 3500 5.2试验用具 5.2.1滤纸:尺寸110mm,等级中速 5.2.2手持放大镜:放大倍数10倍,直径90mm. 5.2.3培养皿;直径90mm. ,250mL,500mL,1000mL,2000 5.2.4烧杯:l00mL ml 5.2.5试管15mmx150 mm 5.2.6量筒.500nL. ,1000mL 5.2.7移液器吸头:10L,200AL,l000L 5.2.8离心管;l.5ml 5.2.9其他;手术刀、手术剪,慑子,酒精灯,研钵,载玻片,盖玻片 试剂和培养基 o 6.1试剂 除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的三级水 PCR反应体系用双 蒸水 6.1.1五氯硝基苯(C,CI,NO.). 6.1.2嚷菌灵(CH,N,S). 6.1.3金霉素(CH.CIN.O),) 6.1.4策霉素(CH.ClN.o.). 6.1.5叙硝股(C,H,CL,N.O.) 6.1.6碗酸链霉素(CaHN,O.S.) 6.1.770%乙醇(CHH.OH) 6.2试剂配制 6.2.1次氧酸钠溶液(0.26%)取有效氧含量为10%的次氧酸钠溶液25mL加水稀释至1000mL. 6.2.2次氯酸钠溶液(0.5%)取有效氯含量为10%的次氯酸钠溶液48ml加水稀释至10o0ml 6.2.3硫酸链霉素溶液(0.1%)取0.1g硫酸链霉素加水溶解,并定容至100mL 6.3培养基 培养基配置方法及步骤见附录B
GB/36821一2018 鉴定 7.1取样方法 按SN/T2122一2015中5.1和5.2规定的取样比例进行取样 7.2症状检查 症状检查参见附录C 逐一对取样产品进行症状观察 观察收集的寄主植株茎基部和根系是否变黑腐烂图C.8、图 C.12),病株茎基部,果针和豆荚是否产生大量成簇橙红色至深红色子囊壳图C.7),叶片是否有退绿变 黄症状(图c.8.图c.I1) 重点观察花生果荚是否变黑(图c.10),种皮表面是否有肉桂色或深棕色斑点 图C.9),这些斑点可能是寄生帚梗柱抱霉的菌丝体或微菌核 疑似的病残体和病子粒要带回实验室 进行显微镜检查和病原菌分离,可轻轻刮取病株表面橙红色子囊壳在体视显微镜下观察,挑取子囊壳制 作玻片,轻压后可见大量子囊喷出(图C.G). 7.3分离培养 种子携带病原分离 7.3.1 将带病斑花生种子先用流水冲洗干净,用无菌接种刀横切成几小块,再用0.26%次氯酸钠溶液表面 消毒！ min,经灭菌水清洗3次后移至含有五氧确基苯、瞎菌灵、金霉素、氧霉素、氯硝胶的选择性培养 基中25C黑暗培养观察,待菌落出现挑取菌落边缘菌丝进行分离纯化,获得纯化菌株 7.3.2植株及残体携带病原分离 将采集到的病样冲洗干净,从茎基部病健交界处切下5mm见方组织,经75%乙醇处理1min后， 用0.5%次氯酸钠表面消毒3min,在灭菌水中清洗3次后去除组织表面多余水分,置于加有0.1%硫酸 链霉素的PDA培养基上,于25C黑暗培养48h,挑取菌落边缘菌丝进行分离纯化.获得纯化菌株 7.4形态学鉴定 形态学鉴定参见附录c 挑取上述纯化好的菌株移至V8汁培养基上,28C黑暗条件下培养,大约7d后观察菌落形态特 征,2周后用水作浮载剂制成玻片,镜检,观察菌丝,分生弛子(图C.4),微菌核(图C.5)的形态特征,3周 后观察菌落中橙色至深红色子座,用针挑取子座,用水作浮载剂制成玻片,在显微镜下观察有性繁殖器 官,如子囊壳、子囊、子囊抱子图C.6)等 7.5PCR特异性扩增检测 PCR扩增检测方法见附录D. 7.6测序 如果7.5中PCR扩增结果为阳性,应将PCR扩增产物进行测序比对,以进一步确证是否是花生黑 腐病菌
GB/T36821一2018 8 鉴定特征 8.1形态学特征 形态学特征参见附录C 花生黑腐病菌在PDA培养基上产生白色至鹅黄色菌丝,菌落平伏,质地致密,并产生褐色至深褐 色色素渗人到培养基中(图C.1,图C.2) 在V8汁培养基上产生灰白至白色菌丝,菌落质地稀疏,边缘 整齐,为规则的圆形,但在V8汁培养基上不产生任何色素 花生黑腐病菌在V8汁培养基产生的微菌 核(图C.5)、分生弛子(图C.4)和子囊壳最多 分生袍子梗呈扫帚状,二叉或三叉分支(图C.3),袍梗顶 端为产抱细胞,瓶状,顶端无色 分生袍子圆柱状,直立,透明,1个3个隔膜,大多为3个,大小为 27.3丛m70.9m)×(4.1m6.8m) 有性时期子囊壳橙红色至深红色,倒卵形或梨形,单生,大 将子囊壳制作玻片轻压后有大量子囊喷出,子囊 小(337.5" 一609.4m)x(309.4 丛m一496.9丛m) Am1 无色棍棒状,具长柄,内含8个子囊弛子 子囊袍子无色,长纺锤形至镰刀形,略弯曲,两端钝圆,具1 个3个分隔,大小(27.3丛m一54.5Mm)×4.1 1一6.8Hm),分隔处常缢缩 Mm 8.2PCR检测特异性产物 用花生黑腐病菌特异性引物进行PCR扩增,在琼脂糖凝胶电泳检测中可观察到279p的PCR产 物条带(见附录D) 结果判定 9 若分离菌的形态学特征符合8.1中花生黑腐病菌的病原特征,且PCR扩增检测结果为阳性,并经 测序比对与花生黑腐病菌的序列相似性在99%以上,可判定检测结果为检出 10 菌种保存 将分离出来的真菌接种在V8汁培养基斜面上,待斜面表面布满菌丝后,封好斜面瓶口,置于4C 保存
GB/36821一2018 附 录 A 资料性附录 花生黑腐病菌其他信息 A.1分布 亚洲:日本、印度、韩国、鲜、印度尼西亚、斯里兰卡,伊朗,广东) 北美洲;美国、洪都拉斯 南美洲;巴西 大洋洲澳大利亚 非洲:咯麦隆 A.2寄主 花生(Arachis hypogaeaL.),大豆(Glyeinema.r L)北美鹅掌揪(Lini rriodlenclronlulii/eral. 茶树(The 、猪屎豆属Cyotalariaspp.)、蓝莓(VaceiniumcorymbosumL)、番木瓜 heaesinensisl.)、 CaricapaayaL.),夏威夷寇阿相思木(Ad Acaciakoa Gray)北美枫香(Liquin tdambarstyracifhuaL. Planeh),夹竹桃(Neriuoleander lctinidiaehinensis 红叶火筒树Leea L.、弥猴桃树Ae cocciea Planch),南美山蚂蛆[De. Desmodiwmtor'4ouSw.DC],决明(Si Sena obtasifliaL.),鹧鸪豆(Ca. as.sia L.)豪威椰子(Hn asciculateMichx)、西印度樱桃NMalpighiaglabra oweabelmoreanaBecc.、红掌 Linden),月桂树(L Laurusnobi/is、L.),鳄梨(Per Mill.)、首蓓 Anthri471andraea7n47 rseaaerica7na Medlicd SatizaLinn ccago A.3症状 Calonectriailieicola引起的花生黑腐病从苗期至成熟期皆可发生,苗期发病往往不结荚果即已死 亡,成株期发病后叶片退绿变黄、后期萎蔫,罹病植株茎基部和根系变黑腐烂,病株茎基部、果针和果荚 上可产生大量成簇橙红色至深红色子囊壳,最后导致整个植株萎蔫死亡 成株期发病可产生带菌种子 带菌种子的种皮表面有肉桂色或深棕色斑点,这些斑点可能是寄生帚梗柱抱霉的菌丝体或微菌核 带 菌种子是花生黑腐病远距离传插的主要途径 带菌花生果荚变黑,种子表面可携带大量的菌丝和微 菌核 Calonetriailicicwla还可侵染大豆引起大豆红冠腐病,引起叶片枯萎变黄,叶脉间逐渐变成棕色 叶片和叶柄同时脱落,引起根系和茎基部腐烂,导致植株萎薇死亡,在茎基部产生橙红色子囊壳 A.4与近似病害的比较 与近似病害的比较见表A.1
GB/T36821一2018 表A.1花生黑腐病与花生新赤壳基腐病的比较 病害 症状 病菌形态 罹病部位变黑腐烂,维管束变 花生黑腐病 褐,橙红色至深红色子囊壳出现子囊壳颜色为橙红色至深红色,比花生新赤壳 Calonectriailicicola 在茎基部、根系、果针和果荚,最基腐病子囊壳颜色更红更深 后整株植株叶片枯娄,娄端死亡 罹病花生植株的茎基部和根系 花生新赤壳基腐病 腐烂,病株茎基部、主根和果荚 比花生黑腐病子囊壳略小,颜色偏粉红色 Neoeoss/porw 上可产生成簇的粉红色的子 Zsinfectavar.arica1a 囊壳
GB/36821?2018 ? B 淶?? ? PDA B.1 6g 20g ? 20g ?1000mL,121C?20min~25nmin B.20.1%ùDA ??1LPDAмù1mL,?0.1%ùPDA B.3? ??1LPDA??50C()?,? 52.5mg),?(2.3mg)ù(100mg)ù(100mg),(2mg),?,?? B.4V8? 100mL V8?? CaCO. 0.2 g ? 20g min25min ??1000mL121C?20
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GB/T36821一2018 附 录 D 规范性附录) 花生黑腐病菌PCR扩增检测方法 主要仪器设备 D.1 D.1.1电子天平;称量范围0g200g,精度0.01g D.1.2高速冷冻离心机;温度控制范围一9C一10C,最大相对离心力20913g(a400r/min) D.1.3pH计;测量范围0.0014.00,测量精度士0.01 D.1.4水浴锅;控温范围在室温至100C,控温精度士1C D.1.5常规PCR扩增仪;温度范围一5C105C,温度变化速率可达3.0C/s,控温精度士0.3C,孔 C 间温差士0.4 D.1.6电泳仪:电压10V300V,最小可调1V,电流4mA400m.A,最小可调1 mA D.1.7生物分光光度计带宽5nm(230nm一320nm).7nm(562nm一595nm),测定范围0.000A~ 3.000A,准确度1A时为士1%,精确度1A时为<0.5% D.1.8凝胶成像系统;灵敏度为0.lngEB染色的DNA,信噪比>56dB ,100 ,200丛L,l000 D.1.9微量可调加样器:l0AL,20AL. AL AL D.2试剂 D.2.1试剂 除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的三级水 PCR反应体系用双 蒸水 D.2.1.1十六烧基三甲基溴化铵(CTAB) D.2.1.2溴化乙锭(EB). D.2.1.3三胫甲基氨基甲烧(Tri) D.2.1.4 乙 二胺四乙酸(EDTA). D.2.1.5蛋白酶K(ProteinaseK. D.2.1.6 三经甲基氨基甲榄(Tis)饱和前 D.2.1.7 三氯甲烧(CHCl,). 异戊醉(C,H.oO. D.2.1.8 异丙醇(c,H.O) D.2.1.9 D2.10Tu聚合群,TunDNA聚合是啃热性细菌Tlermw.uaties来源的热稳定重组型Tn NA聚合酶,分子量为94kD. D.2.1.11dNTPs;PCR核苷酸混合物为dATP,dCTP,dGTP和drTP等摩尔的预混物,各自的浓度 为10mmol/L(pH7.5) D.2.1.12DL2000DNAMarker;是由2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp共6条双链 DNA片段组成,浓度为400ng/5l 10
GB/36821一2018 D.2.2试剂配制 D.2.2.1十六婉基三甲基澳化铵(CTAB)提取液:取cTAB4g,NaCl16.364g,lmTris-HCl20ml pH8.0),0.5mEDTA8mlL,加70ml双蒸水溶解,再定容至200ml.灭菌 D.2.2.2澳化乙锭(EB)溶液(o.5g/ml)取EB100mg,加去离子水溶解,定容至100ml得到 10mg/mlL的EB储液,再取10AL EB储液加水到200" ml D.2.2.3Tris-EDTA缓冲液TE):取1ml的1mTris-HCl(pH8.0),0.2ml的0.5mEDTA pH8.0),用双蒸水定容至100ml D.3DNA提取(CTAB法 D.3.1取病原菌菌丝0.l只于液氮中研磨至粉末状,置于1.5mL 离心管中,加人300AL一500山L CTAB提取液(其中含0.1g蛋白酶K)混匀,6C水浴1h. D.3.213000哲离心5min10min,保留上清液 D.3.3加人500ALTris饱和阶:三氧甲烧:异戊醉(体积为25:24:1)混匀 D.3.413000哲离心5min10min,保留上清液 D.3.5加人500AL三氯甲炕:异戊醇(体积为24:;1)混匀 D.3.613000！离心5min一10min.保留上清液 D.3.7加人1mL异丙醇混匀,一70C下放置1h,或一20C过夜 D.3.813000！离心30nmin,可见DNA沉淀 D.3.970%乙醇洗DNA沉淀,室温干燥 D.3.10用50L100LTE或双蒸水溶解DNA,测定DNA浓度,置于一20C保存待用 注也可采用适用的商品化试剂盒进行DNA提取 D.4PCR引物 根据花生黑腐病菌(C.parasiticu um)的微管蛋白基因(Btubulin)序列设计特异性引物,所对应的 PCR产物大小为279bp引物序列如下 0420F:5'-CGGAGGACAAGGTTGCTGACTATTATTTC-3 0420R;5'-CAGGCGAGCGTTTTATTTTAACCACA-3 注引物序列引自盖云鹏.花生和大豆根茎部腐烂病鉴定和花生黑腐病菌的检测.华南农业大学硕士学位论 文,2012 D.5CR扩增 采用25alLPCR反应体系,10×PCR缓冲液(含Mg+)2.5L,dNTPs(10mmol/L)2.0L.,引物 10mol/L)各1AL,Tuq酶(5U/L)0.5L模板DNA1L去离子水17L. 每次PCR检测应设立相应的阳性对照、阴性对照和空白对照 PCR反应条件;预变性:94C5min,变性;94C30s,退火:57C30s,延伸;72C1min,35个循 环,延伸;7210min 1
GB/T36821一2018 D.6PCR扩增结果判定 PCR扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳检测,EB溶液染色,凝胶成像观察结果 送检样品 阳性对照均出现279bp条带、而阴性对照和空白对照均未出现相应条带,PCR扩增结果判定为阳性;送 检样品阴性对照和空白对照均未出现279bp条带,仅阳性对照出现279bp条带,PCR扩增结果判定 为阴性 D.7测序 对PCR扩增结果为阳性的样品,需将PCR扩增产物进行测序比对,以进一步确证是否是花生黑腐 病菌 扩增片段序列如下 CGGAGGACAAGGTTGCTGACTATTATTTCTTTCTCAATTCTAGGTCCACCTCCAGACC GGTCAGTGCGTAAGTGATCATTCCAGCTTCCAAAAACTGCCCTGGGGATTCACTAACATTC GCGATCAGGGTAACCAAATTGGTGCTGCTTTCTGGCAGACCATCTCTGGCGAGCACGGCCT CGAcAGcAATGGTGTcTAcAAcGGTAccTccGAccTcCAGTTGGAGcGcATGAAcG;TcTAc TTCAAcGAGGTATGTGGTTAAAATAAAAcGcTcGCcTG 12
GB/36821一2018 参 考文献 盖云鹏 花生和大豆根茎部腐烂病鉴定和花生黑腐病菌的检测.华南农业大学硕士学位论 文,2012. [[2]盖云鹏,潘汝谦,徐大高,等 进境检疫性有害生物 -寄生帚梗柱抱霉.植物检疫,2014(4): 76-81 [3]潘汝谦,关铭芳,徐大高,等 花生黑腐病菌的生物学特性.华中农业大学学报,20116): 701-706. [4]潘汝谦,关铭芳,徐大高,等 警惕花生黑腐病菌的人侵 植物保护,2011.37(1);164165. [5]CrousPw，wimngfieaMJ，AlenasAc.Cyhimdrnladiwmarasiticunsp nov.，anew nameforC.crotalariae MycologicalResearch,1993,97(7):889-896. D M，Stipes R [6 Glenn Phipps neidenceandsurvivalofCyindroeladium arasiticuminpeanutseed.PlantDisease，2003，877):867-871 K G Krigsvold Garren H，Griffin lmportanceofpeanutfieldcultivationand soybeancroppinginthespreadofCylindrocladiumcrotalariaewithinandamongpeanutfields Plant DiseaseReporter，1977，6l:495-499 SoumaJ，Takeda OccurrenceofSoybeanRootNecrosisCausedbyCaloneetriailicicola inHokkaidoAnnualReportoftheSocietyofPlantProtectionofNorthJapan，2002，53:101-104. [9]TazawaJ，TakahashiM，UsukiK，etal.Nodulationduringvegetativegrowthofsoybeanm stagedoesnotaffectthesusceptibilitytoredcrownrotcausedbyCalonectriailicicola.Journalof GeneralPlantPathology2007，73(3):180-184 13

花生黑腐病菌检疫鉴定方法GB/T36821-2018

1. 前言

花生是我国重要的经济作物之一，也是世界上最主要的油料作物之一。然而，由于种种原因，花生黑腐病菌已成为一个严重的问题，它会导致花生大量减产和质量下降。

2. GB/T36821-2018标准介绍

GB/T36821-2018《花生黑腐病菌检疫鉴定方法》是中国农业部颁布的技术标准，旨在规范花生黑腐病菌检疫鉴定工作，确保花生无黑腐病菌污染。

3. 花生黑腐病菌的检疫鉴定方法

花生黑腐病菌的检疫鉴定方法主要包括样品采集、传统鉴定方法、分子生物学鉴定方法。

3.1 样品采集

在进行检疫鉴定之前，必须首先进行样品采集。采集的花生应当是新鲜的，且植株上没有任何的病斑。采集时应避免对花生造成机械损伤，否则会影响后续的检测结果。

3.2 传统鉴定方法

传统鉴定方法主要采用形态学和生理学的特征辨识花生黑腐病菌。通过观察它的培养特征、菌落形态、孢子形态等来进行判断。这种方法比较容易操作，但其准确性受到操作者经验及外界环境等因素的影响。

3.3 分子生物学鉴定方法

分子生物学鉴定方法是近年来发展起来的一种新型的检测技术。它利用PCR扩增技术，可以直接从样品中检测花生黑腐病菌的基因序列，从而进行鉴定。这种方法准确性高，且可以在较短时间内得到结果，是一种非常有前途的检测技术。

4. 总结

花生黑腐病菌给花生种植带来了很大的影响，为了保护花生作物的健康，我们需要对其进行检疫鉴定。GB/T36821-2018标准规范了花生黑腐病菌的检疫鉴定方法，我们应当按照标准要求进行操作，以确保检测结果的准确性和可靠性。

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