GB/T36851-2018
辣椒细菌性斑点病菌检疫鉴定方法
DetectionandidentificationofXanthomonasvesicatoria
- 中国标准分类号（CCS）B16
- 国际标准分类号（ICS）65.020.01
- 实施日期2019-04-01
- 文件格式PDF
- 文本页数14页
- 文件大小3.04M
以图片形式预览辣椒细菌性斑点病菌检疫鉴定方法
辣椒细菌性斑点病菌检疫鉴定方法
国家标准 GB/T36851一2018 辣椒细菌性斑点病菌检疫鉴定方法 DeteetonandidentfieatonwfXanthomonas vesicatoria 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 币国国家标准化管理委员会国家标准
GB/36851一2018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
请注意本文件的某些内容可能涉及专利
本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口
本标准起草单位:检验检疫科学研究院、绥芬河出人境检验检疫局、中华人民 共和国甘肃出人境检验检疫局、农科院生物技术研究所、山东出人境检验检疫局
本标准主要起草人:田茜、张箭、尤波、王溪桥、赵文军、李为民、历艳
GB/36851一2018 辣椒细菌性斑点病菌检疫鉴定方法 范围 本标准规定了辣椒细菌性斑点病菌的样品制备、,分离培养及分子生物学等检测方法
本标准适用于可能携带辣椒细菌性斑点病菌的辣椒植株及种子等样品的检疫鉴定
辣椒细菌性斑点病菌基本信息 中文名;辣椒细菌性斑点病菌 Dodge 1920)Vauterinetal.1995 学名:Xanthomonas飞esicatoriae.g 异名:Xanthoonascampestri、pv.esicatoriaDoidge)Dye,BacteriuneritiosumGardner& Kendrick1921,BacteriunzuesicatoriaDoidge1920,BacteriumvesicatoriumDoidge1920,Phytomonas e.ritiosaGardner Kendrick)Bergeyetal.1923,PhytoonasuesicatoriaD.)Stevens1925,Phyo 8 e工itios monasesicatoria DoidgeBergey al.1930,Pkytomona.s K.Bergeyetal.1923 Kendrick1921 1921 Pseuudloonase.Zitiosa Gardner Pseudono7na.se.itios7 PseudoonasgardneriSutie1957 seuudloonasgardlnerivar.cabsie seuudloo7as7es catoriaDoidge)Stevens1925 .Zo1obodlispV. vesicatoriaDoidge)Vauterinet 1995 q1thomonqSesicatorialD.IowsOn 英文名:Bacterialleafspotof 分类地位;细菌界(Bacteria),变形菌门(Proteobacteria),y-变形菌纲(Gammaproteobacteria)， 黄 单胞菌目(Xanthomonodales),黄单胞菌科(Xanthomonodaceae),黄单胞菌属(Xanthomonas) 传播途径;辣椒细菌性斑点病菌主要通过带菌种子进行远距离传播,亦随受侵染的植物残体及茎杆 等传播
在温室,带菌种子是唯一重要的初侵染源,但幼苗移栽也是重要的传播途径
近距离传播主要 借由雨水飞溅或喷洒灌溉传播
辣椒细菌性斑点病菌的其他信息参见附录A
方法原理 根据辣椒细菌性斑点病在寄主植物上的症状进行初步判定;根据辣椒细菌性斑点病菌的特异性 DNA序列进行分子生物学检测;根据辣椒细菌性斑点病菌的培养性状、生物学特性、寄主范围及危害症 状等对病原菌进行分离培养及致病性测定
仪器设备和主要试剂 4.1仪器设备及用具 RCR仪、实时荧光CR仪.超净工作台、高压灭菌锅,恒温培养箱、制冰机、高速冷冻离心机,台式 小型离心机、超低温冰箱常规冰箱,旋涡振荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统等
4.2主要试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯
选择性培养基配制方法见附录B;分子生物学检测所需试剂
GB/T36851一2018 见附录C和附录D. 检疫鉴定方法 S 5.1症状检查 参照附录A中的症状描,重点检查植株的叶片及果实等部位是否具有辣椒细菌性斑点病的疑似症 状
病害的典型症状是;番茄果实表面产生软木塞状斑点或疮痂,边缘水溃状,卵形或不规则,辣椒果实 上很少产生症状,但早期感染可引起落果;番茄和辣椒叶片上,病痕出现不规则水溃状,初为绿色,后逐 渐变成褐色并坏死,详见附录A病害症状描述
注意与番茄叶斑病菌(Pseudomonassyringaepv.to mato)引起的症状区别,后者引起的斑点明显小,并且病斑后期有明显的黄色晕圈
对出现典型症状或可疑症状的植株进行拍照记录,并采集表现症状的植株送实验室进行检测鉴定， 田间无症状植株可随机采样
5.2样品制备 5.2.1植株样品 对于有症状样品,低倍显微镜下观察病健交界处组织有无溢菌现象,若有溢菌现象,选取新鲜组织 叶片或果实)上的病健交界处(对于无症状样品,随机选取植物组织),在75%乙醇或含有效氯1%的次 氯酸钠溶液中表面消毒50s一60s,无菌水清洗3次,然后将其移至灭菌培养中,加5滴~10滴无菌 水,用灭菌锻子或剪刀将病组织捣碎,静置5min10nmin,即制成组织悬浮液,用于分离培养及分子生 物学检测 5.2.2种子样品 对于种子样品,取2000粒种子(重点挑取畸形、不成熟的种子)倒人无菌的三角瓶或其他容器内 加人适量0.05mol/几磷酸吐温缓冲液使种子完全浸设,轻轻摇晃20s一30、混匀,在4C下浸泡过 夜
将浸泡液100:/min离心lmim,去沉淀，上清液10000r/min离心10min,弃上清液,取沉淀,用 无菌水悬浮,制成1ml2ml样品悬浮液,用于分离培养及分子生物学检测
5.3分子生物学检测 5.3.1模板制备 对于植株或种子样品,按照5.2的方法制备成样品悬浮液后,直接用商业化植物基因组DNA提取 试剂盒,按照操作说明提取样品总DNA,一20C保存备用
对于分离培养得到的疑似菌株,可直接或经裂解处理后(97C沸水浴10min;12000r/min离心 10min,取上清液，一20C保存)作为分子生物学检测的DNA模板
根据实验室条件,可选择下列任一方法(5.3.2或5.3.3)进行检测
5.3.2PCR凝胶电泳检测 对于种子、植株等样品,以已知带菌的淖椒种子或植物组织作阳性对照(若无已知带菌材料,可用模 拟带菌方式代棒),.以健康的辣椒种子或植物组织作阴性对照,以双燕水代替模板作为空白对照,对待渊 样品进行PCR凝胶电泳检测
对于纯培养菌株,以X.esicatoria标准菌株作阳性对照,用非X.vesiatoria的植物细菌作阴性对 照,以双蒸水代替模板作为空白对照,对待测样品进行PCR凝胶电泳检测,具体检测步骤见附录C
GB/36851一2018 5.3.3实时荧光CR检测 对于种子、植株等样品及纯培养菌可进行实时荧光PCR检测,具体步骤见附录D,对照设置同5.3.2
5.4分离培养鉴定 对于叶片和果实等植株样品,按照5.2.1的方法制备成组织悬浮液后,用灭菌接种环蘸取悬浮液在 mTMB和CKTM培养基平板上划线分离,重复3次
对于种子样品,按照5.2.2的方法制备成样品悬浮液后,用无菌水进行10倍梯度稀释3次,各取 100AL稀释液在mTMB和CKTM培养基上涂板或直接用灭菌接种环蘸取样品悬浮液在mTMB和 CKTM培养基平板上划线分离,各重复3次
同时用已知的X. 标准菌株接种上述两种半选择性培养基作为阳性对照
将所有培养 .esicatoria 皿平板置于26C28C恒温培养箱中培养
分别于培养3d,5d、7d后进行观察
依据下述X.w es 病菌在各种选择性培养基上的菌落形态,挑选出可疑菌落,在营养琼脂(NA)培养基上纯化2次 catoria 3次,随后进行分子生物学鉴定,致病性测定或Biolog鉴定
菌落呈黄色、稍微黏稠,圆形,隆起
x,wesiadoria能利用吐 在mTMB培养基上, .Uesicatoria 温,3d7d后,在黄色菌落周围形成白色水晶状的晕圈
有些X.esicatoria菌株仅能形成模糊的晕 圈,或仅能在菌落背面形成透明晕圈或只是透明区(不明显 注白色水晶状的晕圈是由于吐温被分解,钙沉积在透明区的结果 X.7esicatoria 在CKTM培养基上形成的菌落与mTMB上相似,呈黄色、稍微黏稠、圆形、隆起
3d7d后,在黄色菌落周围,因钙结晶粉末沉积,常具有白色晕圈
有些X. 菌株仅能形成 .esicatoria 模糊的晕圈,或仅能在菌落背面形成透明晕圈或只是透明区(不明显)
5.5Biolog鉴定 利用Biolog微生物自动鉴定系统对分离纯化的菌株进行鉴定,按照说明书进行操作及结果判定
5.6致病性测定 选择23真叶期、容易发病的辣椒或番茄小苗(3周一4周)进行接种
使用无菌水将纯培养的菌 株配制成10CFU/ml的细菌悬浮液
用无针头的注射器,轻轻使力,从叶背让细菌悬浮液渗透到叶 片里,每个菌株接种3株一5株,以清水做对照
在27C32C,8h~12h交替光照,90%~100%相 对湿度下培养,每天观察,并记录出现水溃病斑的时间
通常致病性的X.esicatoria在2d一4d内形 成水溃状病斑
没有致病性的细菌在24h内则产生过敏性反应,或者根本不会产生病斑
结果判定 6 6.1植株样品 对于有典型症状的植株样品,分子生物学检测结果为阳性,即判定为检出辣椒细菌性斑点病菌
无 症状植株样品,分子生物学检测结果为阳性,经分离培养、致病性测定或Biolog鉴定为阳性,即判定为 检出辣椒细菌性斑点病菌
6.2种子样品 对于种子样品,分子生物学检测为阳性,即初步判定为检出辣椒细菌性斑点病菌,若分离培养、致病 性测定或iolog鉴定为阳性,则确定种子样品检出具有活性的辣椒细菌性斑点病菌
GB/T36851一2018 样品及资料保存 7.1样品及菌种保存 样品经登记和经手人签字后妥善保存
对检出辣椒细菌性斑点病菌的样品应保存于4C冰箱中 以备复核
该类样品保存期应后应经高压灭菌后方可处理
从检测样品中分离并鉴定为辣椒细菌性斑 点病菌的菌株,应妥善保存
可采用甘油保存或冻干保存
对不需要长期保存的菌株应及时灭菌处理 7.2结果记录及资料保存 完整的实验记录应包括:样品来源,种类,时间,检测时间、地点、方法和结果等,并要有实验人员和 审核人员的签字
现场检疫发现的可疑症状、培养基上的菌落特征和人工接种的典型症状等应及时拍 照保存,PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片,荧光PCR检测需有原始数据
GB/36851一2018 录 附 A 资料性附录 辣椒细菌性斑点病菌其他信息 寄主范围 A.1 主要侵染辣椒、番茄以及其他多种茄科作物,自然寄主包括;蓟罂粟Argeonemericana,辣椒属 Ca办sicum、辣椒Capsicumannuum、青椒Capsicumchinensis,辣椒Capsicumffutescens、多刺曼陀罗 Daturaferor、毛曼陀罗Daturaimo.ria,天仙子Hyoseyamusniger、番茄属Lycopersicon,契斯曼尼番 茄Lycopersico.cheesmani、晋茄Lycopersiconesculentwm、秘鲁番茄Lycopersiconerueianu、假酸 浆 小酸浆Physalisminima ruvian,弗吉民亚酸Physal 灯笼果Physal alisbe lis Nicandrapysaloies、 Ti virginiana、,马铃薯Sola nlantuberosm ha;接种寄主包括曼陀罗 inosporacordifolia Daturastraonium、黄若Hyoscyvausaureus 枸杞 长叶构杞Lyeciumhalimifo lciunchinese Lycopersiconhirsutum、黄花烟草Nicotianarustica Solanumdulcamara 毛番茄L ,茄So i41、 龙葵Solanu 2nuubimbinellifoliun1、茄属)Solanurostra 茄属)Solan lanum1melongena anum1nigrum1、 ,蒜芥茄Solan mbrifoliwm、红果龙葵Solawmwosm,豇豆 1vi6na t a7mSsym unguiculata
A.2地理分布 该病菌在全世界较温暖地区的番茄和辣椒上广泛发生,具体如下 非洲;埃及、埃塞俄比亚、肯尼亚、马拉维摩洛哥,莫桑比克、尼日尔,尼日利亚、留尼旺,塞内加 尔,塞舌尔、南非,坦桑尼亚,多哥、突尼斯、赞比亚、津巴布韦 -美洲;安提瓜和巴布达、,阿根廷巴巴多斯、百慕大,巴西(巴伊亚、戈亚斯、伯南布哥、圣保罗)、智 利、哥伦比亚、哥斯达黎加、古巴、多米尼加岛、多米尼加共和国、萨尔瓦多、格林纳达、瓜德罗 普,危地马拉、洪都拉斯,牙买加,马提尼克、墨西哥,巴拉丰、波多黎各、圣卢西亚,圣基茨尼维 斯、圣文森特和格林纳丁斯、苏里南、特立尼达和多巴哥、美国亚利桑那州、加利福尼亚州、佐 治亚州、夏威夷州、爱荷华州、密歇根州、新墨西哥州、北卡罗来纳州、俄亥俄州俄克拉荷马 州、乌拉圭、委内瑞拉、维尔京群岛(美国); 亚洲印度(卡纳塔克邦),以色列哈萨克斯坦,巴基斯坦、菲律宾、; 欧洲;奥地利、阿塞拜疆、白俄罗斯、保加利亚、捷克共和国法国、德国,希腊,匈牙利意大利 撒丁、西西里)、荷兰、波兰、罗马尼亚、俄罗斯(俄罗斯中部,南部、塞尔维亚、斯洛伐克、斯洛 文尼亚,西班牙,瑞士,土耳其,英国(英格兰): 大洋洲:澳大利亚(新南威尔士州、昆士兰州、塔斯马尼亚州、维多利亚州、西澳大利亚州、斐 济、密克罗西亚、新咯里多尼亚,新西兰、帕劳、汤加
A.3病害症状 辣椒细菌性斑点病菌有的菌株可同时侵染番茄和辣椒,有的只侵染其中一种
该病原菌可侵染寄 主植物的叶片、,茎杆和果实
在叶子上的症状多表现为黑色、不规则的油状小病斑(直径约3mm). 病 斑较多时,叶片变黄、表面粗糙,后期脱落
受侵染的花器常严重脱落,在幼果上可形成水溃状、略微隆 起的小病斑,有淡绿色晕圈(3mm一6mm)
后期晕圈消失,病斑凹陷,变成暗褐色,表面结痛
幼苗症
GB/T36851一2018 状,育苗后期幼苗长出3片~4片真叶时开始发病,下部叶片出现银白色水浸状的小病斑,后变为暗色 凹陷病斑,如防治不及时会引起落叶,重病株下部叶片全落光,只留下苗尖
辣椒叶片,辣椒果实和番茄 果实受害症状参见图A.1图A.3 图A.1辣椒叶片受害症状 图A.2辣椒果实受害症状 图A.3番茄果实受害症状 注:图A.l图A.3引自https://gd.eppo.int/taxon/XANTVE/photos
GB/36851一2018 A.4菌体形态及培养特性 辣椒细菌性斑点病菌是严格好氧型的革兰氏阴性菌,菌体杆状,单独或成对出现,大小约为0.64mX (1 4m~1.5m),可通过单极鞭毛运动
在酵母汁-葡苟糖-碳酸钙培养基(YDC)和NA培养基上生长 时,菌落较大,表面平滑、黏稠状,黄色,边缘规则
在King'、B培养基菌落不呈现荧光
对三苯基四陛 oliumchloride,TTC)敏感,氧化酶反应阴性,能使明胶液化,能氧化葡萄糖、甘露糖、阿 Gtriphenyltetrao 拉伯糖、甘油等,不能氧化鼠李糖,对乳糖氧化不稳定
GB/T36851?2018 ? B 淶??) B.1-??(pH=7.4) ?7.75g,1.65g,-20,0.2mL B.2mTMB ?A: (HBO 0.1g 10.0g ? ? 10.0g ?δ 0.25g ? 5.0g 10.0ml ?B: -80 0.065 ?(cephalexin) g 5-(5-luorouracil 0.012g 0.0002 ù(tobramyein) g ??(??,cyoheximide) 0.2g ?е?A??,1000ml??,l21,?15min ?45C50C,?B B.3 CKTMI ?A 2.0 ??? g ??(tryptone) 2.0 g 1.0 g L-?(L-glutamine) 6.0 g L-鰱(L-histidine) 1.0 g [(NH,),HPO] 0.8g 1.0 8 ??MgSO7H.o 0.4 ??? 0.25g ?齺 1 ? 15.0g ?B: -80 10ml 0.065 ?(cephale exin g 5-(5-fluorouracil 0.012g 0.0004 ù(tobramycin) g ?(??,cycloheximide 0.l g
GB/36851一2018 0.1 杆菌肽(bacitracin) 1g 硫酸新霉素(neomyeinsulfate) 0.01g 称取所有的试剂A组分到适宜的容器中,加人990ml蒸馏水,121,高压灭菌15min
将培养 基冷却到45C50C,加人试剂B
GB/T36851一2018 附 录 规范性附录) PCR凝胶电泳检测方法 C.1引物序列 Bs-XvF;5'-CCATGTGCCGTTGAAATACTTG-3' Bs-XvR;5'-ACAAGAGATGTTGCTATGATTTGC-3' C.2PCR反应体系及条件 25L反应体系;2×PCR反应预混液12.5"L,引物Bs-XvF(10mol/L)1L,引物Bs-XvR 10Amol/L)1AL,模板1L,补充超纯水至25AL
)s,64c PCR反应程序;:94C5min;95C30s 30s,72C30s,40个循环;72C10min;4C保存 注:不同仪器可根据具体要求将反应参数作适当调整
琼脂糖凝胶电泳 制备2%的琼脂糖凝胶,按比例混匀电泳上样缓冲液和PCR扩增产物,用DNAMarker作为分子 量标记,进行电泳分析,电泳结束后在凝胶成像仪的紫外透射光下观察是否扩增出预期的特异性DNA 条带,并拍摄记录实验结果
扩增产物片段大小为138bp C.4结果判定 在阳性对照在预期大小位置产生明显条带,阴性对照和空白对照在预期大小位置未产生条带的情 况下 如果检测样品出现与阳性对照大小一致的条带,则为阳性 如果检测样品没有出现与阳性对照大小一致的条带,则为阴性
0
GB/36851一2018 录 附 D 规范性附录 实时荧光CR检测方法 D.1引物及探针序列 xCV-F-F;5'-GGATGGGCAGcGTATcTTTC3” xXcV-F-R;5'-CAAACAGCATTTcCAcCTTGAA-3' XCV-F-P;5'FAM)-cCTGAAGCGAAGcTCTGCC'AAGTcG;-(BHQ1): D.2实时荧光CR反应体系及程序 20L反应体系:2×Pr emixExTaq10L,引物(10mol/L)各1AL探针(10mol/L)0.5AL,模 板1AL,补充超纯水至20MlL 实时荧光PCR反应程序:第一个循环为92C3min;随后40个循环,92C5s,60C30 s
注:不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整
D.3结果判定 在阳性对照Ct值<34,阴性对照和空白对照的Ct值>40前提下: 如果检测样品的Ct值<35时,则判定为阳性; 如果检测样品的Ct值>40时,则判定为阴性; 如果35
GB/T36851?2018 B,Germain [1]KoenraadtH,vanBetteray R,HiddinkG,JonesJB,OosterhofJ,Rijlaarsdam A RoordaP&WwoudtB2009)Dey forthemoleculardetectionofbacterial speeificprimers velopmentof spotofpepperandtomato.Proceedingsofthe2ndInternational symposiumonTomatoDiseases.(Eds H.Saygii,FSahin&.YAysan)ActaHorticulturae808,99-102. McGuireRG,Jones SasserM1986)TweenmediaforsemiselectiveisolationofXan thoonascambestrispv,zesicatoriafromsoilandplantmaterial.PlantDisease70,887-891 ParkDS,ShimJK,KimJS,LimCK,ShresthaR,HahnJH&KimHG2009)Sensitiveand athovar-specificprimers speeifiedeteetionofXanthomonascampestrispv.esicatoriubyPCRusingpa basedonrhsfamilygenesequences.MicrobiologicalResearch164,36-42 SijamK,ChangC GitaitisRD(1992)Amediumfordifferentiatingtomatoandpepper nJournalofPlantPathoogy strainsofXanthoonascampestrispv.Tesicatoria.Canadian 14,182-184.
辣椒细菌性斑点病菌检疫鉴定方法GB/T36851-2018
辣椒是我国重要的蔬菜作物之一，也是世界上广泛栽培的作物之一。然而，辣椒被细菌性斑点病菌感染时，会导致叶片出现黄化、叶斑、枯死等症状，给辣椒产业带来极大损失。因此，对辣椒细菌性斑点病菌进行检疫非常重要。
目前，针对辣椒细菌性斑点病菌的检测方法主要有生物学方法、分子生物学方法和免疫学方法等。其中，分子生物学方法是最为敏感、快速、可靠的方法之一。
国家标准GB/T36851-2018《辣椒细菌性斑点病菌检疫鉴定方法》规定了辣椒细菌性斑点病菌的检测标准和方法。该标准主要包括样品采集、DNA提取、PCR扩增、电泳分析等步骤。使用该标准可以有效地检测出辣椒中细菌性斑点病菌的存在，确保辣椒产品的质量和安全。
然而，需要注意的是，由于病原体检测技术的不断更新和发展，检测方法也会随之不断变化。因此，在使用GB/T36851-2018标准进行检测时，需要结合实际情况，及时更新相应的操作方法和技术流程，以保证检测结果的准确性和可靠性。
综上所述，辣椒细菌性斑点病菌的检疫鉴定对于确保辣椒产品的质量和安全具有重要意义。我们需要根据国家标准GB/T36851-2018，选择适当的检测方法进行检测，并及时更新操作方法和技术流程，以确保检测结果的准确性和可靠性。
辣椒细菌性斑点病菌检疫鉴定方法的相关资料
- 了解GB/T30382-2013标准：辣椒的品质要求
- 辣椒及其油树脂总辣椒碱含量的测定分光光度法GB/T30389-2013
- 高效液相色谱法测定辣椒及其油树脂总辣椒碱含量
- 番茄斑萎病毒检疫鉴定方法GB/T31802-2015
- 辣椒粉显微镜检查法GB/T32731-2016
- 辣椒细菌性斑点病菌检疫鉴定方法GB/T36851-2018
- 镁合金压铸安全生产规范GB26488-2011
- 商用车前下部防护要求GB26511-2011
- 进出境货物木质包装材料检疫管理准则GB/T28060-2011
- 鳞球茎花卉检疫规程GB/T28061-2011
- 薇甘菊检疫鉴定方法GB/T28109-2011
- 无损检测射线照相底片数字化系统的质量鉴定第2部分：最低要求GB/T26141.2-2010
- 无损检测射线照相底片数字化系统的质量鉴定第1部分：定义、像质参数的定量测量、标准参考底片和定性控制GB/T26141.1-2010
- 火灾技术鉴定方法第5部分：气相色谱-质谱法GB/T18294.5-2010
- 火灾技术鉴定方法第2部分：薄层色谱法GB/T18294.2-2010
- 纯血马DNA亲子鉴定技术规程GB/T26612-2011
- 辣椒细菌性斑点病菌检疫鉴定方法GB/T36851-2018
