GB/T38086-2019
生物样品中金属硫蛋白含量的测定
Determinationofmetallothionein(MT)inbiologicalsamples
- 中国标准分类号（CCS）A40
- 国际标准分类号（ICS）07.080
- 实施日期2019-10-18
- 文件格式PDF
- 文本页数11页
- 文件大小810.60KB
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生物样品中金属硫蛋白含量的测定
国家标准 GB/T38086一2019 生物样品中金属硫蛋白含量的测定 ofmetalohionein(Mr)inbogsiteal Detemination samples 2019-10-18发布 2019-10-18实施 国家市场监督管理总局 发布 币国国家标准化管理委员会国家标准
GB/38086一2019 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC387)提出并归口
本标准起草单位:国家农业标准化监测与研究中心(黑龙江、深圳市计量质量检测研究院、上海市 计量测试技术研究院、成都大学四川抗菌素工业研究所、吉林省检验检疫局技术中心、哈尔滨商业大学 食品学院、哈尔滨春源生物科技开发有限公司
本标准主要起草人:王志强、王韦达、董珊、周、杜业刚,李兰英、杨晨、容会、张根生、张福源,吴楠、 彭丽萍、王世堪、姜雯、刘文超、孔鲁裔、牟钰、徐凤霞、王海宽、李碧芳、杨俊、李意、刘奕雄、杨国武
GB/T38086一2019 生物样品中金属硫蛋白含量的测定 范围 本标准规定了生物样品中兔源金属硫蛋白I型和型(MT-I和MT-I)测定的液相色谱-串联质 谱法
本标准适用于生物制剂或生物提取物等生物样品中兔源金属硫蛋白I型和I型总含量的测定
本方法的检出限为6.2mg/kg
规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
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GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 术语和定义、缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1.1 特征肽段speeifepypeptde 唯一在靶蛋白的胰蛋白酶水解产物中发现,其氨基酸序列具有专属性的多肽
3.1.2 金属硫蛋白metallothionein -类富含半胱氨酸且具有高度结合金属能力的低相对分子质量蛋白质
3.1.3 金属硫蛋白I型和I型metalothioneinIandI 在大多数哺乳动物的内脏器官中广泛存在,尤以肝、肾细胞为主,而且参加其功能调节的一类蛋 白质
3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件
DTT:;二硫苏糖醉(Dithiothreitol IAA:;碘代乙酰胺(2-Iodoacetamide MT:金属硫蛋白(Metallothionein) 原理 试样经胰蛋白酶酶切后产生特征肽段,用液相色谱-串联质谱法测定试样中特征肽段的含量,按照 兔源MT-I和MT-I平均相对分子质量与特征肽段的相对分子质量比值为6.16,计算出试样中MT-I
GB/T38086?2019 MT-? ? 5 ??GB/T6682й涨?? 5.1?(NHHcO.); 5.2 (CHOS.); 5.3(ICH,cONH,); 5.4??:,10000BAEEUnit/mgBAEE?????? -18?档 5.5(HCOOH);?? 5.6?(CHCN);?? 5.7??(100mmol/L):?0.395g?,??50mL 5.8??(1nmol/L);?1.542g?,???10ml 5.9?(lmol/I);?1.850g,???10ml 5.10???(2004g/mL):?204g??100L???? 5.11?(0.1%,):?1.0mL,?1000mL 豸 ??-.? 6.1 6.2??:5000Da10000Da(1Da~1.6610-?kg). 6.3??l.5ml 6.4?;0.01g,0.00001g 6.5 L 6.6??;1AlL~104L,20" 200L,100"l 1000AL 6.7??;??14000r/min 6.8??:37C 7.1?κ? CAQGCICK???,δ,е???? ,?[CAM]?????A??18C?档 7.2?? ?δ?;????0.0020g1.0ml??,?2.04g/aL ?,-18C?,Ч1? ??????δ?,?160Lк?? 0.4g,0.6"g,0.84gl.0g1.2"gl.4g1.64gl.8g2.0"g??,?
GB/38086一2019 7.3测定 7.3.1试样制备 称取0.002g(精确至0.0001g)试样,置于1.5ml低吸附离心管中,用1mL碳酸氢铵溶液溶解 混匀
移取125L溶液转移至另一低吸附离心管中,加人875"L碳酸氢铵溶液,涡旋混匀,待酶解
7.3.2试样酶解 取上述试样40AI置于1.5ml低吸附离心管中,依次加60AI碳酸氢铵溶液,4ALDTT溶液,混 匀后37C恒温水浴1h;冷却至室温,加人20ALIAA溶液,避光静置30min,对半胱氨酸进行炕基化 修饰;转移全部溶液至预先用碳酸氢钱溶液润湿的蛋白超逃管中,l4000!/min4离心30min;加人 100L碳酸氢铵溶液洗膜,14000r/min4丫离心30min.再重复两次;加人100AL碳酸氢铵溶液于超 滤管中,再加人10L胰蛋白酶溶液,混匀后37C恒温水浴酶解12h16h;将酶反应物14000r/minm C离心洗脱,再加人50aL碳酸氢铵溶液洗脱,收集两次含特征肽段的洗脱液混匀待测
7.3.3仪器参考条件 7.3.3.1液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下所示 mm×50mm,1.7 色谱柱:C柱(2.1 Hm)或柱效相当者; a b 流动相;梯度洗脱条件见表1; 流动相流速:0.3mL/min; c d 色谱柱柱温:30C; 样品室温度:4C; e f 进样体积:4l
表1流动相梯度洗脱参考条件 时间 0.1%甲酸溶液(体积分数 乙晴(体积分数 % % min 95 0.5 3.5 30 10 90 4.0 " 5.
95 95 6.0 7.3.3.2质谱参考条件 质谱参考条件如下 离子化模式电喷雾电离正离子扫描模式 a 质谱扫描方式:多反应监测MRM) b 喷雾电压(IS);5500V; c d 雾化气压力(GS1):0.379MPa; 辅助气压力(GS2):0.379MPa; e
GB/T38086一2019 fD 气帘气压力(cUR):0.276MPa; 离子源温度:550C; 8 裂解电压(DP):70V; h) i 碰撞能量(CE)30eV MRM的质谱参数;参见表2
表2MRM的质谱参数 名称 母离子m/: 子离子m/ 836.4 765,3 金属硫蛋白 637.3 498.7 特征肽段 360.l 307. 232. 注:“关”为定量离子
7.3.4定性判定 选择待测组分的1个母离子,6个子离子进行MRM监控
在相同试验条件下,待测样液中待测物 质的保留时间,与标准工作溶液的保留时间偏差在士2.5%之内,且待测样液中待测物定性离子的相对 丰度与浓度接近的标准工作液中对应的定性离子的相对丰度进行比较,最大允许偏差符合表3的规定 则可判定为试样中存在目标肽段
特征肽段的选择离子色谱图参见附录B. 表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 >20%一50% >10%~20% <10% >50% 士20% 士25% 士30% 士50% 允许的最大偏差 7.3.5标准曲线的制作 将标准工作溶液依次注人液相色谱-串联质谱仪,测定相应的峰面积
以标准工作溶液的浓度为横 坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线
7.3.6试样的测定 将待测样液注人液相色谱-串联质谱仪,按照7.3.3确立的参考条件与参数,以498.7>637.3为定量 离子对测得的峰面积进行定量
7.3.7空白试验 用100AL碳酸氢铵溶液,按照7.3的步骤进行空白试验
7.3.8加标试验 试样经过还原、婉基化修饰、洗涤除去DTT和IAA后,酶切前或者酶切后添加一定水平含量的特 征肽段,进行加标回收试验,回收率参考范围为80%~120%
GB/38086一2019 结果计算 用式(1)计算试样中MT-I和MT-的总含量 -exYxdxs -×100 式中: 试样中MT-I和MT-I的总含量,%; -试样溶液中MT-I和MT-l特征肽段的质量浓度,单位为微克每升(4g/L); -酶解溶液和洗脱溶液的总体积(160!L); -试样溶液的总稀释倍数(8×25); 试样的质量,单位为克(g)
m 以重复性条件下获得的两次独立测定结果的平均值表示,结果保留两位有效数字
精密度 在重复性条件下,获得的两次独立测定结果的绝对差值,不得超过算术平均值的15%
GB/T38086一2019 附 录 A 规范性附录) 合成的特征肽段物质信息 合成的特征肽段物质技术要求 A.1 合成的特征肽段物质技术要求应符合表A.1的规定
表A.1合成的特征肽段物质信息表 序号 名称 英文名称 要求 序列 c[CAM]AQGc[CAM]Ic[CAM]K Sequence 相对分子质量 RelativeMoleeularWeight 995 纯度 Purity >95% Appearance 白色粉末 外观 A.2合成的特征肽段含量测定 A.2.1测定条件及典型色谱图 A.2.1.1测定条件 仪器;高效液相色谱仪,配备紫外检测器 mm×250 色谱柱;反相ODS色谱柱,4.6 mm,5Mm; 流动相A:0.1%三氟乙酸乙晴溶液; 流动相B;:0.1%三氟乙酸水溶液; 进样体积:20pL 检测波长;220 nm; 流速:l.0mL/min 梯度洗脱见表A.2
表A.2梯度洗脱 时间/min 流动相A/% 流动相B/% 0.0 93 25.0 32 68 25. 100 停止 30,0 A.2.1.2合成的特征肽段典型色谱图 合成的特征肽段用高效液相色谱测定,典型色谱谐图见图A.1
GB/38086一2019 爸 味 7 20 1213 5T678122122224252 10 保留时间/min 图A.1合成的特征肽段典型色谱图 A..2.2测定结果 用高效液相色谐测定含量,采用面积归一化法进行定量
测定结果列于表A.3 表A.3测定结果 出峰时间/min 浓度/% 出峰顺序 峰面积 l0.667 9969.210 0.3185 3051753,.500 97.512l 10.803 11.192 30015.551 0.9591 11.753 27372.822 0.8746 14.300 10505.104 0.3357 A.3合成的特征肽段相对分子质量确证 A.3.1质谱条件 仪器设备;液相色谱-串联质谱仪; 离子源:ESI 扫描模式:正离子扫描; 雾化气流速:1.5L/n min; 离子源电压:4.5kV;
GB/T38086一2019 加热模块温度:200C; CDL温度:250; 液相流速:0.2mL/min; 流动相:水:乙睛=1:1
A.3.2合成的特征肽段分子离子质谱图 合成的特征肽段分子离子质谱图见图A.2. x10" 996.35 lM十 4.0 3.5 3.05 " 1.5 1.0 0.5 575.90 0.0- 500 750 100o 1250 150o m/5 图A.2合成的特征肽段的分子离子质谱图 根据质谱图可知,采用[M+H]*离子模式得到m/为996.35的合成特征肽段离子图,确证合成 的特征肽段的相对分子质量为995
GB/38086一2019 附录B 资料性附录 M-I和M-I特征肽段的选择离子色谱图 MTI和MT-I特征肽段的选择离子色谱图见图B.1
1.01E十06 498.7>836.4 5.10E+05 1.00E+04 1.oIE+06 98.7>765.3 5.10E十05 1.00E+04 1.01E+06 498.7>637.3 5.10E+05 1.00E+04 1.01E+06 498.7>360.1 5.10E+05 1.00E+04 1.0IE十06 498.7>307.1 5.10E十05 1.00E+04 1.01E+06 498.7>232.1 5.10E+05 1.00E+04 保留时间/min 图B.1M-I和M-I特征肽段的选择离子色谱图
生物样品中金属硫蛋白含量的测定GB/T38086-2019
金属硫蛋白是一种重要的代谢产物，可作为监测环境污染和生物毒性的指标之一。因此，在生物样品中准确测定金属硫蛋白的含量具有重要意义。
GB/T38086-2019标准规定了一种测定生物样品中金属硫蛋白含量的方法。该方法基于紫外-可见分光光度法，通过巯基乙酸钠还原金属硫蛋白并使其发生局部变性，然后使用5,5'-二硫代二(2-氨基丙磺酸)酸（DTNB）作为试剂，与被还原的金属硫蛋白中的游离巯基反应生成黄色的TNB（2-硫基-4-硝基苯酚）产物，测定光密度从而计算出金属硫蛋白的含量。
具体实验步骤如下：
- 样品制备：将生物样品加入适量缓冲液，超声条件下破碎细胞壁，离心去除细胞碎片。
- 还原：加入巯基乙酸钠（DTT）溶液将样品中的氧化态金属硫蛋白还原为还原态。
- 局部变性：加入硫酸铵使得还原后的金属硫蛋白发生局部变性，暴露出巯基。
- 反应：加入DTNB试剂与被还原的金属硫蛋白中的游离巯基反应生成黄色TNB产物。
- 测定：使用分光光度计测定TNB的吸收光密度。
该方法简便、快速、准确，并且对于不同类型的生物样品都有较好的适用性。但是，测定过程中需要注意遮光，以保证测定结果的准确性。
