GB/T28080-2011
小麦印度腥黑穗病菌检疫鉴定方法
DetectionandidentificationofTilletiaindicaMitra
- 中国标准分类号（CCS）B16
- 国际标准分类号（ICS）65.020.01
- 实施日期2012-06-01
- 文件格式PDF
- 文本页数21页
- 文件大小1.36M
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小麦印度腥黑穗病菌检疫鉴定方法
国家标准 GB/T28080一2011 小麦印度腥黑穗病菌检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofTilletiaindicaMitram 2011-12-30发布 2012-06-01实施 国家质量监督检监检疫总局 发布 国家标准花管理委员会国家标准
GB/r28080一2011 目 次 前言 范围 规范性引用文件 小麦印度腥黑穗病菌基本信息 方法原理 检疫鉴定流程 取样方法 未经加工小麦取样方法 加工小麦取样方法 6.2 袋装面粉抽样比例 主要仪器设备和试剂 7.1主要仪器设备 7.2主要试剂 检测与鉴定 8.1样品前处理 8.2形态学鉴定 8.3单个冬抱子直接分子检测 8.4抱子培养物的分子检测 8.5序列测定与比对 结果判断与表述 9.1形态学鉴定结果判断和表述 9.2单个抱子直接分子检测结果判断和表述 9.3袍子培养物分子检测结果判断和表述 9.4序列测定与比对 10 样品和原始数据保存 10.1样品保存 10.2原始数据保存 附录A资料性附录)小麦印度腥黑穗病菌其他信息 附录B规范性附录形态学鉴定 附录c资料性附录)小麦印度腥黑穗病菌与近似种的抱子显微形态图和扫描形态图 附录D(规范性附录单个冬抱子直接分子检测 附录E规范性附录袍子培养物常规PCR检测 16 附录F规范性附录抱子培养物实时荧光PCR检测 ** 18 附录G规范性附录序列测定与比对
GB/T28080一2011 前 言 本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口
本标淮起草单位;深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院 本标准主要起草人:章桂明、程颖慧、王颖、陆清凌杏元、龙海、陈枝楠、向才玉、杨伟东、缪建
GB/T28080一2011 小麦印度腥黑穗病菌检疫鉴定方法 范围 本标准规定了小麦印度腥黑穗病菌的检疫鉴定方法,包括形态学方法和分子生物学检测方法,规定 了小麦印度腥黑穗病菌检疫鉴定流程,明确了取样和样品保存方法
本标准适用于小麦及其加工产品传带的小麦印度腥黑穗病菌的检测
本标准也适用于除小麦以外的该病菌其他寄主传带小麦印度腥黑穗病菌的检测
规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 件
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18085植物检疫小麦矮化腥黑穗病菌检疫鉴定方法 GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求 小麦印度腥黑穗病菌基本信息 中文名:小麦印度腥黑穗病菌
学名;TilletiaindicaMfitra 异名;Neoossiaindica(Mitra)Mundlkur 病害英文名;karnalbuntofwheat(简称KB),partialbuntofwheat 属真菌界Fungi,担子菌门Basidiomycota、黑粉菌纲Ustomycetes、黑粉菌目Ustilaginales,腥黑粉 菌科Tleiaceae,腥黑粉菌属Tletia
小麦印度腥黑穗病菌主要通过发病种子和附着于健康种子表面的冬抱子进行远距离传播,也可随 土壤及其他农用工具进行传播
小麦印度腥黑穗病菌的其他信息参见附录A
方法原理 根据小麦印度腥黑穗病菌的生物学和形态学特征以及分子生物学特征,应用相关仪器,包括显微镜 和PCR仪等对小麦印度腥黑穗病菌进行鉴定
检疫鉴定流程 检疫鉴定流程见图1
GB/r28080一2011 样品 洗涤 镜检 未发现疑似KB袍子 发现疑似KB袍子 查找蒲蚁 单个冬袍子分子检测 发现疑似KB菌效 未发瑰疑似KB菌蚁 冬袍子萌发 附录D) 判定为不带KB袍子 形态学整定 袍子培养物分子检洲 进行形态学鉴定 附豪E、附、陌象G 附录A、附浪B、附录c 或分子检测 结果判定 结果判定 菌效或洗涤检验 菌亵或洗涤检验 菌想或洗涤检验 结果呈阴性 结果呈阳性 袍子平均值在 抱子平均值大于 抱子平均值小于 判定为非KB 判定为KB 5" m35m 猫um为 猫wm为非KB 间做分子检测 图1小麦印度腥黑穗病菌检疫鉴定流程图
GB/T28080一2011 取样方法 未经加工小麦取样方法 按照GB/T18085取样方法进行取样
6. 2 加工小麦取样方法 实施堆垛抽样时,在堆垛四周按正弦曲线从上,中,下层随机确定抽样点
实施船舱内货物抽样时,以50m为一个抽样区,每区设中心及四角(距边缘1m处)五个抽样点
每增加一个抽样区,增加三个抽样点
集装箱或车厢装载的麦綦,面粉抽样参照船舱抽样方法进行
6.3袋装面粉抽样比例 10袋以下,逐袋抽样 10100袋,随机取10件
100袋以上,按一批货物总袋数的平方根数抽取见式(1
n= 式中: N -批货物的总袋数; 应抽取件数(n值取整数,小数部分向上修约. 主要仪器设备和试剂 7.1主要仪器设备 7. 1.1摇床
7.1.2显微镜
7.1.3纯水器 Z.儿.4调序仪 Z.1.5电涨仪 ZI.
低温冰箱. 2，7 显微操作仪 16 超净工作台 7.1.9高压灭菌斜 刀.1.10光照培养箱 7.1.11旋涡振荡器 7.1.12普通离心机
7.1.13冷冻干燥机
7.1.14凝胶成像仪
7.1.15核酸蛋白分析仪
7.1.16PCR仪(常规PCR仪、实时荧光PCR仪)
破壁针(具有平截切面的针,能将袍子压醉) 7.1.17 7.1.18培养(9c cm
GB/r28080一2011 .19筛网(53m,204m) 7. 1. 7.1.20孔径1004m的毛细管
7.1.21锥形瓶(250ml500mL) 7.1.22盖玻片(18mm×18mm) .,0.5mL). 7.1.23PCR反应管(0.2mL. 7.1.24载玻片(25， mm×76mm,厚(0.8 mmml.0mm)
7.1.25Tip头(0.lAL10AL,5AlL200L,l00l~1000L.). 7.1.26可调微量移液器(2L,l0L,20AL,100L,200AL,1000L 7.2主要试剂 7.2.1三氯甲炕
7.2.2异戊醇
.2.3异丙醇
7 7.2.4醋酸销 7.2.5甲酸胶 7.2.670%乙醉 7.2.7无水乙醉 7.2. .8 Tris饱和酚
.2.9Taq酶
.2.10Gelatin. 72 ..11澳化乙锭
7.2.12DNAMaker 13 PDA培养基 刀.2 7.2.14水琼脂培养基 7.2.15sD5提取液 7.2.16PcR缓冲液 17 .2. 电泳缓冲液
7 .2.18上样缓冲液
7 .2.19Bigdye试剂盒
7 .2.20TaqManUniversalPCRMasterMix
7.2.21席尔氏浮载剂,见GB/T18085
7.2.22dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)
注除另有规定外,所有试剂均为分析纯或生化试剂 检测与鉴定 样品前处理 8.1.1实验室器皿和筛网的前处理 将所有实验器皿和筛网浸泡于1.6%的次叙酸钠中15min.然后用无菌水冲洗5次 8.1.2面粉中抱子的获取 将面粉样品充分混匀,称取50g置于250mL锥形瓶中,加人100mL无菌水,搅拌均匀后倒人直径
GB/T28080一2011 为9cm的玻璃培养皿中,使面粉溶液在培养皿中均匀成一薄层,再将培养皿置于解剖镜下镜检,用解剖 针挑取深色冬抱子用于形态学鉴定或分子生物学检测
形态学鉴定 对查找到菌!,或通过洗涤检验获得冬袍子的,先进行形态学鉴定
对菌燃采用解剖针挑取菌的 冬抱子,置于席尔氏液中制片,对洗涤检验采用滴管吸取冬袍子悬浮液制片,待冬抱子胶质鞘充分展开 后,进行封片,观察冬袍子的大小,形状,颜色、外袍壁结构,在100×油镜下测量冬袍子的大小,每个样 品测量100个冬袍子 形态学鉴定的具体操作过程见附录B,KB与近似种的形态学图参照附录C
8.3单个冬袍子直接分子检测 对未查找到菌瘦,但通过洗涤检验发现疑似小麦印度腥黑穗病菌冬袍子的,要进行单个袍子分子方 法检测
每个PCR反应检测1个冬袍子,共检测5个冬袍子
每次PCR检测应设立相应的阳性对照、 阴性对照和空白对照
单个冬袍子直接分子检测具体操作过程见附录D. 8.4抱子培养物的分子检测 对未查找到菌!,但通过洗涤检验发现疑似小麦印度腥黑穗病菌,而这些疑似小麦印度腥黑穗病菌 通过形态学和单个袍子检测无法获得准确结果时,则要对袍子进行培养(培养方法见E.1),用培养物进 行分子检测
每次PCR检测须设立相应的阳性对照、,阴性对照和空白对照
袍子培养物分子检测具体操作过程见附录E,附录F
8.5序列测定与比对 将PCR产物纯化后,进行测序,或由生物公司完成
把测序所得到的核苷酸序列与已知的小麦印 度腥黑穗病菌相应序列进行比对
序列比对具体操作过程见附录G
结果判断与表述 9.1形态学鉴定结果判断和表述 对查找到的菌癌中的冬袍子或通过洗涤检验获取的冬抱子,所观察的症状和形态学特征与小麦印 度腥黑穗病菌冬抱子的一致,且对其100个抱子大小测量平均值大于35m,则判定该样品含有小麦印 度腥黑穗病菌;对其100个袍子大小测量平均值小于25m,则判定该样品不含有小麦印度腥黑穗病 菌;对其100个抱子大小测量平均值介于25m354m,则判定该样品含有疑似小麦印度腥黑穗病菌， 应进行进一步分子检测
9.2单个抱子直接分子检测结果判断和表述 9.2.1常规CR检测结果判断和表述 对单个袍子进行PCR检测,在阳性对照、阴性对照和空白对照,结果均正常的情况下,如通过电泳获 取260bp条带,且测序比对与小麦印度腥黑穗病菌一致的判定为该样品含有小麦印度腥黑穗病菌;如 没有PCR扩增条带的则应挑取袍子进行萌发,进行分子检测
GB/r28080一2011 9.2.2实时荧光CR检测结果判断和表述 对单个抱子进行MGB探针实时荧光PCR检测,在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的 情况下,则: -检测ct值小于或等于38,判定小麦印度腥黑穗病菌检测结果呈阳性; 检测C值大于36,应重做实时荧光PCR,如再次扩增后,Ct值小于或等于36,判定同上,如cCt 值大于36,则需要挑取冬袍子进行萌发,用抱子培养物进行分子检测
9.3抱子培养物分子检测结果判断和表述 g.3.1常规PCR检测结果判断和表述 对袍子培养物进行常规PCR检测,在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下,如样品 扩增产生414bp(引物Tin3/Tin4)或260bp(引物P12)的特异性条带,则初步判定小麦印度腥黑穗病菌 检测结果呈阳性,但需进一步进行实时荧光PCR检测或序列测定与比对进行结果验证,按照实时荧光 PR检测或序列测定与比对结果进行最后结果判定;如样品无特异性扩增条带,则判定小麦印度腥黑 穗病菌检测结果呈阴性
9.3.2实时荧光CR检测结果判断和表述 9.3.2.1普通探针实时荧光PCR检测结果判断和表述 普通探针的实时荧光PCR检测,在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下,则 -检测Ct值小于34,判定小麦印度腥黑穗病菌检测结果呈阳性; 检测Ct值大于或等于34,判定小麦印度腥黑穗病菌检测结果呈阴性
9.3.2.2MGB探针实时荧光PCR检测结果判断和表述 MGB探针实时荧光PCR检测,在阳性对照,阴性对照和空白对照结果均正常的情况下,则 -检测ct值小于或等于38,判定小麦印度腥黑穗病菌检测结果呈阳性; -检测Ct值大于或等于40,判定小麦印度腥黑穗病菌检测结果呈阴性 -检测Ct值在36一40之间,应重做实时荧光PCR,再次扩增后,如Ct值小于或等于36或者Ct 值大于或等于40,判定同上
9.4序列测定与比对 把测序所得到的核苷酸序列与已知的小麦印度腥黑穗病菌相应序列进行比对,如果与已知的小麦 印度醒照穗病菌序列完全一致,则判定小麦印度醒黑穗稍菌检测结果呈阳性,不- -致则判定小麦印度腥 黑穗病菌检测结果呈阴性 样品和原始数据保存 10 10.1样品保存 存查样品应视样品的状态采用相应的保存方式,妥善保存6个月
如发现小麦印度腥黑穗病菌,该 样品应保存1年,以备复验,如涉及到贸易纠纷则应保存到纠纷解决完毕
保存期满后,需经灭菌处理
10.2原始数据保存 样品检测结束后,其原始记录单和检验报告或证书应归档,妥善保管,以备复验,谈判和仲裁
GB/T28080一2011 附 录A 资料性附录 小麦印度腥黑穗病菌其他信息 A.1分布 小麦印度腥黑穗病大多分布于亚洲、北美洲、南美洲和非洲等少数几个国家
亚洲印度、阿富汗、巴基斯坦、伊拉克、尼泊尔
北美洲;墨西哥、美国
南美洲;巴西 非洲:南非 A.2形态特征 病菌冬抱子堆(sporemass)粉状,褐黑色,由冬袍子及不孕细胞组成,新鲜时有恶臭
不孕细胞球 形至长椭圆形,常呈泪珠状,淡黄色至淡黄褐色,具有光滑而厚的裂片状的胞壁,并常有一个菌丝附属 丝
冬袍子无鞘,有时具有一个菌丝附属丝,球形或近球形,红褐色(几乎不透光),直径25um一43um (平均35pm),袍壁犹刺状,犹突截形.1l.5Am一5pm. A.3寄主范围及症状 小麦印度腥黑穗病菌自然寄主为小麦Trm ,硬粒小麦(Trilicwmdwrwm n)及小黑麦 riticnaestiu Trihicumaesivwm×Secalecereale)
在人工接种条件下,尚可感染下列寄主植物;耐酸草(Brom4s ciliatus)、旱雀麦(B.tectorum)、加那利黑麦草(Loliumcanariense)、意大利黑麦草(L
muliflorum)、黑 麦草(L.erenne),波斯黑麦草(L 一粒小麦Trilicummoococcum、野生一粒小麦 perS1cn、 Triticumboeticum、提莫非氏小麦Triticumtimoheeui、Triticumoheeri、黑麦Secalecereale); 山羊草属(Ae Aegilops):二角山羊草(A. bicornis)、尾状山羊草(A. 、顶芒山羊草(A. caudlata con0sa" mulica、A
searsi、沙伦山羊草A，sharonensis)、粗山羊草A，taaschi、Atriarisana riunciale等 . 小麦印度腥黑穗病菌主要为害小麦穗部
其症状特点是对寄主穗部的局部侵染,当感病小麦进人 糊熟期时,开始出现症状,在有的品种上,病穗一般较健穗短,感病麦株通常表现为部分麦穗发病,感病 麦穗也常表现为部分小穗受到感染,病穗通常局部黑粉化
成熟时在受害籽粒的腹沟处果皮下形成黑 粉菌腔
感病轻微的,腹沟症状不明显,仅在子粒表面形成暗褐色庖斑,种子发芽率不受影响;感病严重 时则病粒全部或大部分形成黑粉腔,外表由菌体化果皮包被,病菌损伤胚及毗邻的胚乳,种子不发芽或 虽发芽只形成畸形弱苗;病粒中的黑粉由于病原菌产生三甲胺而散发出腐鱼腥臭味
病菌抱子堆形成 于子房中,轻微膨胀或不膨胀,几乎完全为颖片所覆盖
A.4传播途径 病粒及附着于健康种子表面的冬袍子是病原菌进行远距离传播的主要途径,由于该病局部侵染的
GB/r28080一2011 特性,在收获期间很难有效的清除混杂于健康种子中的病粒,因而病粒可随同贸易性小麦或资源性引种 或科研性引种而进行远距离传播
在小麦收获期间,散落到土壤中的菌壑或从破碎菌壑中落人土壤中的小麦印度腥黑穗病菌冬抱子 随同土壤进行传播
带有袍子的病土也可通过黏附在人,牲畜和农用收获机械等表面进行传播
GB/T28080一2011 B 附 录 规范性附录 形态学鉴定 B.1菌瘦查找 在体视显微镜下,检查小麦种子中有无菌樱
感病较重的种子,菌缨颜色多呈暗紫褐色,不同于健 康种子,感病种子因腥黑粉菌抱子而散发出三甲胶气味
感病轻微的种子,可采用将小麦种子浸泡在水 中检查菌~,即;将待检种子浸泡在水中,沿种子腹面对内秤进行观察
B.2洗涤检验 B.2.1取50g样品放人250mL锥形瓶中,加人100ml无菌双蒸水含0.01%Tween- -20),放于摇床 200 r/min振荡3min以便释放袍子
B.2.2将洗涤液倒在上层的53m的筛网上,20Mm筛网在下层,进行抽滤,用500mL的锥形瓶接收 滤液 B.2.3用100ml无菌双蒸水冲洗250ml锥形瓶中样品2次,然后将洗涤液倒在53m的筛网上,再 用200mL300mL无菌双蒸水冲洗53m筛网,确保袍子从样品上分离
B.2.4移去53Mm筛网,将20m筛网倾斜成45",用无菌双蒸水冲洗将筛网上的袍子冲洗下来,然后 将袍子洗涤液倒人离心管中,l000g离心3min B.2.5用移液管将上清液缓缓吸出,最后加人席尔氏液,定容至100AL500AL,混匀,镜检
B.3形态学鉴定 用解剖针挑起袍子,置于席尔氏液中制片,在显微镜下观察袍子的大小,形状,颜色和袍壁结构在 100×油镜下测量100个冬抱子的大小 B.4结果判定 形态学鉴定结果判定见9.1
GB/r28080?2011 ? c ?? С?????????? C.1С??????(?,2005)μ?c.1 ?C.1С?????? C.2С????羵???(?,2005)μ?C.2 ?c.2С????羵??? 10
GB/T28080?2011 C.3?????(EPPO,2004)μ?C.3 ?C.3????? c.4???羵???(JimmPlaskowitz,2006)μ?cC.4 ?C.4???羵??? 1
GB/r28080一2011 附录D 规范性附录 单个冬袍子直接分子检测 D.1单个袍子核酸制备 菌瘦中冬袍子获取方法用针刺破菌腹,挑取不带植物组织的少许袍子,将这些袍子轻轻展布于载 玻片上,在低倍镜下观察抱子是否分散开,再将单个抱子挑起,直接转移到PCR管的管盖中,在低倍镜 下确认袍子是否已被成功放置
袍子悬浮液中冬袍子获取方法:用显微操作系统(或在倒置显微镜下人工操作)从袍子悬浮液中吸 取抱子,所用毛细管孔径为100m,整个操作过程在检测器上进行监控,也可在显微镜下直接进行观 察,确认袍子已被吸人毛细管内并被转移到PCR管的管盖内
用破壁针对放置在PCR管盖中的抱子实施破壁;在10×低倍镜下用破壁针头轻轻挤压抱子,促使 抱子壁破裂,使抱子中的核酸释放出来,在显微镜下检测抱子壁是否已经被压破
快速将PCR反应混 合液加到PCR管盖中,振荡混匀,然后离心,置于冰上,振荡后离心
D.2分子生物学检测 D.2.1常规CR检测 D.2.1.1常规PCR引物序列 常规PCR引物序列为 正向引物P12-1:5'-GTAATAGccCTGTGCAGAAG-3’ 反向引物P12-2:5'-cGGcGAAGAAAGTcGGATTT-3" D.2.1.2常规CR扩增体系及条件 反应体系总体积为25L,各成分为;2.5l10×PCR缓冲液[Tris-HClpH8.0)10mmol/L. Mg十1.5mmol/L,KCl50mmol/L],2ALdNTP2.5mmol/L),0.25AL各引物104mol/L). 0.3LTuq酶(5U/L),2.5LGelatin[0.01%(wt/vol)门,无菌双燕水17.2L
将反应体系混匀 离心后置于PCR仪中进行反应，每个PCR反应检测1个冬袍子,共检测5个冬弛子
用无菌双蒸水作 空白对照,阳性对照采用含有小麦印度腥黑穗病菌的DNA作为模板,阴性对照以其他腥黑穗病菌 DNA作为模板 反应条件为96C预变性3min,然后进人循环反应:96C变性15s,57.5C退火30s,72延伸 30s,共70次循环,72C延伸10min D.2.1.3琼脂糖凝胶电泳 每个样品取5L的PCR产物与1AL的6×上样缓冲液混合均匀,并加到含有澳化乙锭(0.5g/mL) 的1.2%琼脂糖凝胶的点样孔中,在120V下进行电泳
电泳结束后在凝胶成像系统中观察、拍照,并 保存照片
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GB/T28080一2011 D.2.2实时荧光PCR检测 D.2.2.1实时荧光PCR引物及探针序列 实时荧光PCR引物及探针序列为: 正向引物sZFP254-l;5'-AGCCATCACTGGAGTTGTCATG,3” 反向引物sZFP254-2;5'-CCCAGCAAGGTCACCTTTGA-3 探针序列sZFPb255.5" '-FAM-CCGACCGTATCGGTCT-MGB-3’ D.2.2.2实时荧光PCR反应体系及条件 反应体系总体积为5L.各成分为;实时荧光反应混合液2.5LTaManUniversalPCRMastee Mhix.0.45AL各引物(10pmolL),0.lL探针(10pmol/L),无菌双燕水1.5AL
将反应体系混匀,离 心后置于实时荧光PCR仪中进行反应,每个实时荧光PCR反应检测1个冬袍子,共检测5个冬袍子
用无菌双蒸水作空白对照,阳性对照采用含有小麦印度腥黑穗病菌的DNA作为模板,阴性对照以其他 腥黑穗病菌DNA作为模板
反应条件为50C预热2min,95C变性10min,然后进人循环反应;95C变性15s,60C延伸 1min,共40次循环
对实时荧光PCR仪的程序进行设置,使仪器能进行FAM荧光的检测 D.3结果判定 结果判定见9.2
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GB/r28080一2011 附 录 规范性附录 抱子培养物常规CR检测 E.1抱子萌发 挑取冬袍子,置于2%水琼脂培养基上,l8C20C,每日连续光照12h条件下培养10d,解剖镜 下检查萌发情况
对萌发的袍子用接种针挑取置于PDA培养基上,20C一22C培养20d. E.2抱子培养物的核酸制备 E.2.1称取0.1g培养物，放在无菌的多层滤纸上,吸去水分,置于无菌的研钵中,用液氮冷冻,用研 磨棒将它们研成粉末
E.2.2立即转移到2mL的离心管中,加人65C预热的SDS提取液700l,置于水浴锅中65C水浴 30min,期间不断混匀
E.2.3加人5AL10mg/mLRNA酶,充分混匀,在37C放置30min E.2.4加人等体积的Tris饱和酚,充分摇匀,在12000r/min下离心15min
E.2.5取上清液,加人11三氯甲婉/异戊醉(24:l),在12000r/min下离心15min
E.2.6再取上清液,加人1:1三氯甲烧/异戊醇(24:1),在12000r/min下离心15min
E.2.7加人等体积预冷的异丙醇,轻轻摇晃,置于一20冰箱静置30min,在12000r/min下离心 15min. E.2.8弃上清液,加人70%乙醉500AL,12000r/min下离心3nmin,去上清液,重复2次
得到DNA沉淀,用冷冻干燥仪进行干燥,加人30pL一50LTE或无菌去离子水,充分溶解 E.2.9 后,测量DNA的纯度和浓度后置于一20冰箱中保存
注:该核酸制备也可采用DNA提取试剂盒法
E.3DNA纯度与浓度的测定 用核酸蛋白分析仪测定DNA的纯度与浓度,分别取得260nm和280nm处的吸收值,计算核酸的 纯度和浓度,计算见式(E.1)和式(E.2) DNA纯度=OD.m/OD. DNA浓度(4g/mL)=50×OD E.2 PCR级DNA溶液的oD,/OD比值为1.71.9
E.4常规PCR E.4.1引物序列 引物序列为 正向引物Tin3:5'-CAATGTTGGCGTGGCGGCGC-3” 反向引物Tin4;5'-CAACTCCAGTGATGGCTCCG3” 也可以使用D.2.1中的P12引物
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GB/T28080一2011 E.4.2扩增体系及条件 引物Tin3/Tin4的反应体系总体积为25Al,各成分为;2.5l
10×PCR缓冲液[Tris-HCl pH8.0)10mmol/L,Mg+1.5mmol/L,KCI50mmo nol/1],lALdNTPs(10mmol/L),0.1ML各引物 254mol/L),0.1l.AmpliTaq(5U/L),llDNA10ng/AL),无菌双蒸水20.2l
将反应体系 混匀,离心后置于PCR仪中进行反应,每个反应重复2次
用无菌双蒸水作空白对照,阳性对照采用含 有小麦印度腥黑穗病菌的DNA作为模板,阴性对照以其他腥黑穗病菌DNA作为模板
反应条件为94笔预变性1min,然后进人循环反应:94C变性15s,65C退火15s,72笔延伸15s. 共25次循环,72C延伸6min
引物P12的扩增体系和反应条件见D.2.1.2
E.5琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳见D.2.1.3
E.6结果判定 结果判定见9.3.1
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GB/r28080一2011 附 录 ！ 规范性附录 袍子培养物实时荧光CR检测 袍子萌发 F.1 袍子萌发见E.1
r.2抱子培养物的核酸制备 抱子培养物的核酸制备见E.2
.3DNA纯度与浓度的测定 DNA纯度与浓度的测定见E.3. F.4普通探针实时荧光PCR检测 F.4.1引物及探针序列 引物及探针序列为 引物序列同E.4.1
探针序列为:5'-FAM-ATTCCCGGCTTCGGCGTCACT-TAMRA-3’ F.4.2反应体系及条件 反应体系总体积为25l.各成分为;实时浆光反应混合液12.了A
TraMinUniverslR MaserMix,lAL各引物(10pmolL),l探针(10pmolL),1LDNA10ng/L),无菌双燕水 8.5L
将反应体系混匀,离心后置于实时荧光rCR仪中进行反应,每个反应重复2次
用无菌双蒸 水作空白对照,阳性对照采用含有小麦印度醒黑穗病菌的DNA作为模板,阴性对照以其他腥黑穗病菌 DNA作为模板
反应条件为50C预热2min,95C变性10mimnm 1,然后进人循环反应:95C变性15s,60C延伸 lmin,共34次循环 对实时荧光PCR仪的程序进行设置,使仪器能进行FAM荧光的检测 F.5MGB探针实时荧光PCR检测 F.5.1引物及探针序列 引物及探针序列同D,2.2.1 F.5.2反应体系及条件 反应体系总体积为5AL,各成分分别为:实时荧光反应混合液2.5LTagManUniversalPCR 16
GB/T28080一2011 MasterMix,0.45L各引物(10Amol/L),0.1探针(10mol/L),1ALDNA(10ng/AL),无菌双蒸 水0.5AlL
将反应体系混匀,离心后置于实时荧光PCR仪中进行反应,每个反应重复2次
用无菌双 蒸水作空白对照,阳性对照采用含有小麦印度腥黑穗病菌的DNA作为模板,阴性对照以其他腥黑穗病 菌DNA作为模板
反应条件为50C预热2min,95C变性10min然后进人循环反应:95C变性15s,60C延伸 n,共40次循环
lmi1 对实时荧光P(CR仪的程序进行设置,使仪器能进行FAM荧光的检测
F.6实时荧光PCR检测结果判定和表述 实时荧光PCR检测结果判定和表述见9.3.2 17
GB/r28080一2011 附录 G 规范性附录 序列测定与比对 G.1PCR扩增 用rDNAITS片段PCR扩增方法如下: ITS4引物序列;5'-TcCTccGCTTATTGATATGC-3” ITS5引物序列:5'-GGAAGTAAAAGTcGTAACAAGG-3’ 反应体系总体积为25L,各成分为;2.5AL10×PCR缓冲液[Tris-HCIpHH8.0)10mmol/L Mg+1.5mmol/L.,KCl50mmol/L.],2LdNTPs(2.5mmol/L),1.25L各引物(10pmol/L) 0.3LTa酶(5U/L),lLDNA10ng/AL),无菌双蒸水16.7AL 反应条件为95C预变性10min,然后进人循环反应:95C变性30s58C退火30s,72C延伸 1min,共35次循环,72C延伸71 Imin
电泳检测见D.2.1.3
对符合条件的PCR产物进行纯化,直接测序,具体操作步骤见相关试剂盒 说明书
也可将PCR产物送到生物公司进行测序 也可以用附录D附录E中的常规PCR引物进行PCR扩增
G.2序列比对 把测序所得的核苷酸序列与已知的小麦印度腥黑穗病菌的相对应的序列进行比对
G.3结果判定 结果判定见9.4
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小麦印度腥黑穗病菌检疫鉴定方法GB/T28080-2011
一、 简介
小麦印度腥黑穗病是由真菌寄生引起的病害，可导致小麦产量损失。为了防止疫情蔓延，保障国家的农业生产和贸易安全，必须对进出口的小麦进行检疫鉴定。
二、 GB/T28080-2011标准概述
GB/T28080-2011是我国针对小麦印度腥黑穗病菌检疫鉴定所制定的行业标准。其中包含了样品采集、标本处理、实验方法等方面的规范，并且根据相关法律法规，对检测结果进行了分类处理。
三、 鉴定方法
（一）样品采集
1. 采样时间：对于小麦的出口检疫，应在收获后进行采样；对于进口检疫，则应在运输途中或到达口岸前进行采样。
2. 采样地点：应选择在小麦田间随机采集。
3. 采样数量：每个采样点至少采集20个小麦穗或200个小麦粒，不同区域可分别采样。
（二）标本处理
1. 样品分类：将采集到的样品按区域、品种、生长阶段等因素进行分类标记。
2. 样品储存：样品在采集后立即送往实验室进行处理，若不能及时处理，则需将样品放入冰箱保存，并在24小时内进行处理。
3. 样品制备：将样品在无菌条件下进行表面消毒、去壳、磨粉等步骤，制成检测所需的样品。
（三）实验方法
1. 制备检测物质：制备印度腥黑穗病菌的孢子悬液、DNA提取物等检测所需物质。
2. 培养检验：将制备好的样品在适宜培养条件下进行孵育，并观察是否出现病征。
3. 分子检测：采用PCR技术进行检测，判断小麦印度腥黑穗病菌的存在与否。
四、 结论
GB/T28080-2011标准为小麦印度腥黑穗病菌的检疫鉴定提供了详细的规范和方法，正确使用该方法可以保障小麦产品的安全性，同时也有助于国际农业贸易的健康发展。
