苜蓿疫霉根腐病菌检疫鉴定方法

苜蓿疫霉根腐病菌检疫鉴定方法

国家标准 GB/T35329一2017 首蓓疫霉根腐病菌检疫鉴定方法 DetetiwnamdidentifieationofPhyophahora medicaginis E.MHans.etD.P.Maxwel 2017-12-29发布 2018-07-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/35329一2017 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口 本标准起草单位:天津出人境检验检疫局、检验检疫科学研究院 本标准主要起草人;张裕君、杜洪忠,郭京泽,贺艳,刘鹏,刘跃庭,吴品珊
GB/35329一2017 首蓿疫霉根腐病菌检疫鉴定方法 范围 本标准规定了首楷疫霉根腐病菌的检疫鉴定方法 本标准适用于针对首蓓疫霉根腐病菌寄主(参见附录A)的植物,植物产品以及夹带土壤和介质中 的首瘤疫霉根腐病菌的检疫和鉴定 首着疫霉根腐病菌基本信息 学名:Phytobhthoramedicagini、E.M.Hans.etD.P.Maxwel 分类地位;藻菌界(Chromista),卵菌门(Oomycota),霜霉纲(Peronosporea),霜霉目(Peronospora les),霜霉科(Peronosporaceae),疫霉属(Ph.ytobhthora). 传播途径;土壤,流水,栽培介质,幼苗,根部组织均能带菌、传播,贸易调运的干首楷草也有远距离 传播的风险 首楷疫霉根腐病菌的其他信息参见附录A 方法原理 寄主植物发病症状、病原菌的形态学特征和病原菌基因组目标片段的序列特征为鉴定依据样品 采集 仪器和用具 4.1仪器 超净工作台,光照培养箱,人工气候箱,生物显微镜,电子天平(感量0.01g),高压灭菌锅,血球计数 器,恒温水浴锅,高速冷冻离心机,制冰机,分光光度计,PCR扩增仪,电泳仪,凝胶成像系统,荧光PCR 扩增仪 4.2用具 烧杯,三角瓶,量筒,培养皿,酒精灯,毁子,剪刀,解剖刀,接种针,载玻片,盖玻片,塑料研杵,移液 器,移液器吸头,离心管 试剂和培养基 S 5.1试剂材料 除另有规定外,所有试剂均为分析纯 匹马霉素(CHNO),氨节青霉素钠盐(CHN,OSNa). 利福平钠盐(CeH.N.O.),五氯硝基苯(c.CNO.),碳酸钙(Caco.).次氯酸钠(NaOcl 三胫甲基氨基甲婉(CHNO.),氯化钠(NaCl),盐酸(HCI),乙二胺四乙酸四二钠(CHN.ONa).
GB/T35329一2017 氢氧化钠NaOH),十六烧基三甲基澳化铵CHeBrN),电泳缓冲液(1×TAE),无水乙醉 (CH,OH),异丙醉[CH,CH(OH)CH],三氯甲炕(CHCl,),异戊醇(C,HeO),琼脂糖,PCR缓冲液 TaqDNA聚合酶,脱氧核苷三磷酸(dATP,dTTP,dCTP,dG;TP),l00bpDNA分子量Marker,PCR 引物PmF和PmR,实时荧光PCR引物P990-F,P1050-R和探针P1010-Pr 琼脂粉,V8汁 5.2培养基 V8培养基:100mL过滤后的V8液,加人2.5gCaCO.(碳酸钙).17旦琼脂粉,蒸水800mL搅 拌混匀,定容至1000mL,121C,灭菌30min,制备培养基平板备用 选择性培养基PARPV8.50mL过滤后的V8液,17g琼脂粉,800mL蒸溜水,定容至1 1000nml， 121C,灭菌30min,冷却到50C,加人50%的匹马霉素0.01g,氨乍青霉素钠盐0.25g,利福平钠盐 0.01g,五氧硝基苯0.05g,搅拌混匀,制备培养基平板备用 实验室检验 6 6.1症状检查 对于植株样品,重点观察根部有无变色、病斑,植株有无枝条枯萎、顶梢死亡等;如植物携带有土壤 或介质，一并收集;对于干首草等植物产品,挑选色泽异常的,具体症状参见附录A 6.2分离培养和诱集 6.2.1组织分离培养 新鲜植物根、茎组织在流水下冲洗1h2h,在病健交界处或变色部位切取边长为5mm~10mm 的组织块,用75%么醉浸润可接着用15%的次策股悄表面消毒》mn 4min,然后灭菌水冲洗 3次,灭菌滤纸吸干水分,放于V8或选择性培养基PARPV8上 干首楷草用无菌水喷洒,在无菌培养皿中保湿8h12h,无菌水冲洗3次,灭菌滤纸吸干水分,放 于V8或选择性培养基上 培养皿25C黑暗培养4d一6d后,组织周围培养基上长出稀疏菌落,挑取菌落边缘菌丝块转人V8 培养基纯化,25C黑暗培养 6.2.2土壤和介质诱集 称量土块或介质25g,碾碎放人500mL灭菌洁净烧杯中 每份样品加灭菌燕僧水,水面距土表 4.0em左右,然后加人10片左右直径8mm10mm的健康首蓿种子长出的子叶或未成熟苹果的小切 片,切片大小以漂浮在水面为宜,封口膜封口保湿,25C黑暗条件下放置3d5d. 6.2.3诱集检查和培养 诱集3d~5d后，观察首蓿叶片或苹果切片附近是否有棕色病变区.从变色的病健交界处取 5mm×5mm 小块,75%乙醉消毒30s,置V8培养基或选择性培养基PARP.V8,25C黑嗜培养 培养4d6d后,组织周围培养基上长出稀疏菌落,挑取菌落边缘菌丝块转人V8培养基纯化 25C黑暗培养 PCR检测 7.1DNA提取 刮取菌落上的菌丝体(100mg),放人1.5mL离心管中,浸在液氮里预冷,用塑料杵碾碎待用
GB/35329一2017 离心管加人700LCTAB缓冲液(见附录B)混匀,65C水浴30min,期间颠倒混匀离心管2次 3次;13000g离心10nmin,保留上清液;加500pL三氧甲烧异戊醉(体积比为24:1)混匀,l3000g 离心5min10min,保留上清液;再加500l三氯甲:异戊醉(体积比为24:l)混匀,13000g离心 10min,保留上清液;加人0.6倍上清液体积的异丙醉混匀,一70C下放置30min,或一20C放置1h; 1mL经4C预冷70%么醉洗DNA沉淀,130" 离心 13000g离心10min,可见DNA沉淀;加人1 10nmin,小心倒去上清液,重复上述4C预冷70%乙醇洗涤DNA步骤一次,室温或真空干燥系统中挥 干液体;用30Al50ALTris-EDTA缓冲液溶解DNA,待用 根据自身情况也可采用商品化的试剂盒提取菌丝体DNA 7.2DNA浓度测定和定量 样品DNA用紫外分光光度计测定260nm和280nm处吸收值,分别计算核酸的纯度和浓度,计算 公式如下 DNA纯度=ODmw/OD.0 DNA浓度(ng/AL)=50×OD0 DNA的纯度比值应在1.7~1.9之间,浓度定于25ng/l 7.3普通PCR检测 和PmR序列分别为-AAAccTATcAGcGAAccc:了 首蓓疫霉根腐病菌的特异性引物P'mF 5'-ATATTGGACATAACGAGcCT-3',预期扩增片段大小214bp 扩增体系,25AL样品DNA1L(25gDNA),10xPCR缓冲液2.5L.25mmolLMgCl2AL 2.5mmol/儿LdNTP1AL,54mol/L引物各1AL,5U/LTaqDNA聚合酶0.3L,ddH.O16.2AlL 反应条件;94C预变性3min,然后进人循环:95C变性20s.,53C退火30s,72C延伸1min;共 35个循环,最后72C延伸10nmin 在1×TAE电泳缓冲液中,l.5%琼脂糖凝胶电泳,电压2V/em5V/cm,0.5%EB染色15 min 凝胶成像仪分析结果 每个PCR反应设置2个重复,在试样进行PCR反应的同时,应设置阴性对照、阳性对照和空白对 照 以其他种疫霉为阴性对照,以首楷疫霉根腐病菌基因组DNA为阳性对照,以去离子水为空白对 照 各对照CR反应体系中,除模板外,其余组分及PCR反应条件相同 7.4实时荧光PCR检测 实时荧光PCR引物序列为P990-F:5'-GGTGGGTGGAACGAAGGA-3'和P1050-R;5'-TG GCAGcGGAGATcCAA-3',P1010-Pr:5'-(FAM)ccGcGcCAGTATTTGTcTTccGG(BHQ1)-3' 探针5'端标记的荧光报告基团为FAM,3'端标记的荧光猝灭基团为BHQ1 反应体系(25AL);样品DNA1AL(25ngDNA),10×PCR缓冲液2.5AL,25nmmol/LMgC 2L.,2.5mmol/LdNTPs2" L,10mol/L引物(P990-F,P1050-R)各1"L,101 mol/L探针P1010-Pr 15AL5U/ALT 1DNA聚合酶0.3AL.,ddH.o13.7L 反应循环为:94C10min-94C15s,56C60、循环40次 每个PCR反应设置2个重复,在试样进行PCR反应的同时,应设置阴性对照、阳性对照和空白对 照 以其他种疫霉为阴性对照.以首蓓疫霉根腐病菌基因组DNA为阳性对照.以去离子水为空白对 照 各对照PCR反应体系中,除模板外,其余组分及PCR反应条件相同 鉴定特征 8.1形态学特征 菌落密集,白色,边缘平滑 25C时,生长速度大约每天4mm5mm.
GB/T35329一2017 63 38 抱子囊卵形、椭圆形或梨形,无乳突,长27Mm 34m,宽17Mm m 病菌可以产生菌丝膨大体,不规则形,偶见厚垣抱子 该病菌为同宗配合,雄器围生或侧生;藏卵器直径大多数平均37Mm39 m,少数平均324m 43 3m;卵袍子直径平均28m34Mm,壁厚2m44m 参见附录c 8.2普通PCR检测 在空白对照、阴性对照无扩增产物,阳性对照扩增出大小为214bp片段(参见附录D)的情况下,试 样扩增出预期大小片段,判定为阳性,试样无扩增产物或扩增片段大小与预期大小不一致,判定为阴性 8.3实时荧光PCR检测 在阳性对照信号值正常、阴性对照和空白对照无扩增产物的情况下 Ct值小于或等于36,判定阳性; 值大于或等于40,判定阴性 Ct值在3640之间,应重做实时荧光PCR,并加大模板DNA用量,再次扩增后如C值小于 或等于36,或者C'值大于或等于40,判定同上 9 结果判定 病菌的培养性状和形态特征与8.1的描述一致,且普通PCR检测结果呈阳性,或实时荧光PCR检 测结果呈阳性,可判定为首瘤疫霉根腐病菌 10样品保存与结果记录 10.1样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存 对检出苣蓓疫霉根腐病菌的样品应保存于4C冰箱中,以 备复核 该类样品保存期满后须经高压灭菌后方可处理 0.2菌株保存与处理 分离并最终鉴定为首楷疫霉根腐病菌的菌株应转接到试管V8培养基斜面上,存活后经登记和经 手人签字后置于10C培养箱中保存,定期(30d60d)转接,以防止病菌死亡,必要时冻干后保存,至 少保存6个月,保存期满后需经高压灭菌处理 0.3结果记录与资料保存 完整的实验记录包括样品的来源、种类、时间,实验的时间、地点、方法和结果等,并要有实验人员和 审核人员签字
GB/35329一2017 附 录 A 资料性附录 首蓓疫霉根腐病菌相关资料 A.1寄主范围 主要寄主有紫花首蓓(Medicagoxatiua),鹰嘴豆(Cicerarietinum)、野胡萝卜(Daucuscarota),弥 猴桃(Actinidiadeliciosa);次要寄主有红豆草(Onobrychisziciifolia、驴豆(Omobrychisiciifolia) A.2病害症状 种苗期发病导致紫花首蓿萌芽种子和秧苗腐烂死亡;成株染病后根部有红褐色至黑色病斑,严重时 扩展为边缘红褐色的环绕病斑,随后发展为根部腐烂;首蓓叶片的颜色不正常,较低的叶子会变成黄色 至棕红色,萎蔫、脱落;整个植株生长速度缓慢、矮小,早衰、顶梢枯死,严重时整株死亡 鹰嘴豆上发病症状:叶片褪绿、干枯,根部腐烂;主根有小的褐色病斑,可扩大病变为深褐色,再发展 到根颈部,呈现边缘红褐色的环绕病斑 首着根部腐烂症状 首潜田间发病症状 注来源于JohnA.G.Irwin. 图A.1首藉上的症状 A.3地理分布 希腊、日本巴基斯坦、土耳其、南非,加拿大、美国、墨西哥、,阿根廷、澳大利亚 A.4传播途径 土壤,流水,栽培介质,幼苗,根部组织能带菌、传播,贸易调运的干首蓓草也有远距离传播的风险
GB/T35329一2017 附 录 B 规范性附录) 缓冲液的配制方法 B.1CIAB抽提缓冲液 在约800mL水中加人20gCTAB,81.9gNaCl,12.1gTris,7.5gNa,EDTA,用HCl或NaOH溶 液调节pH至8.0,加水定容至1000mL,103.4kPa,121C条件下,灭菌15min,室温保存 B.2Iris-EDIA缓冲液 在约800ml水中加人1.2114gTris,0.3722只Na.,EDTA均匀混合,用HCl或NaOH溶液调节 pH至8.0,将溶液定容到1000mL后,103.4kPa,121C条件下,灭菌15min,室温保存 电泳缓冲液(50xTAE B.3 在约800ml水中加人242.2gTris,18.6只Na,EDTA,用HCl或Na(OH溶液调pH值至8.,0,加水 定容至1000mL 使用时稀释至1×TAE
GB/35329?2017 ? C ?? ù?? ?ù??C.1??C.3? 5m 50m 50m ?:?? ?C.1ù 50m ??? ?C.2?ù? ? 50m 50m ?? ?C.3 ù
GB/T35329一2017 附 录 D 资料性附录) 序 列表 Pmr,PmR扩增序列 D.1 AAACCTATCAGCGAAGGCTGTCCCAAAACCAGTAGGG;ATTTCCTAAGTTcGCACCATIA ATAGTCAGTIACTTAACIAAGTACGCATGCATGGTGATTAATACTCGGTGTTGCGAGGAC 61 121GTGCAGcGITrGACG:TGTTAAACTTCTTCGNTGGGCTAAACGcGCACITTcCTCCAAAACG 81AAAG:TTCCGATGG;AAGGCTcGTTATGTCC'AATAT D.2Pg90-F,P1050-R扩增序列 GGTGG;TGGAANGAAGGAAACCGAAGACAANTACTGGGCGG:TTTGGATCTCCGCTGCC 67
GB/35329?2017 nternational.2007.CropProtection [1]CABInt Compendum,2005Edition.wallingord,UK:CA International. ndiumofAlfalfaDiseases.TheUnitedStates D.C.Erwin.PhytophthoraRootRot.In:Con mpen ,1990.3739. ofAmeriea;TheAmerieanPhytopathologicalSoeiety [3 iesofthePhytophthoramegaspermacomplex.Mycolo HansenEM.MaxwellDP,1991.Spee ,83(3):376-381 gla, [4]ErwinDC,RibeiroOK,1996.PhytophthoraDiseasesworldwide.StPaul,Minnesota,USA American PlsytopathologicalsSosietyPes LiewECYMacleanDJ,IrwinJAG,1998.SpecificPCRbaseddetectionofPhytophthora theinte tergenicspacerregionoftheribosomalDNA.MycologiealResearch.l02;73-80. medieaginisusing

苜蓿疫霉根腐病菌检疫鉴定方法GB/T35329-2017解析

首先，GB/T35329-2017标准明确了苜蓿疫霉根腐病菌检疫鉴定的目的、范围和术语定义等基本原则。

其次，该标准规定了疫霉根腐病菌的检测方法，包括留样、制备试样、提取DNA、PCR扩增、聚合酶链式反应产物检测等步骤。特别地，在PCR扩增过程中，还规定了PCR反应体系的配制、PCR程序和结果判定等关键环节。

此外，GB/T35329-2017标准还详细说明了疫霉根腐病菌检疫鉴定方法的质量控制要求，包括阳性对照、阴性对照、生物学重复和技术重复等方面。这些控制措施可以有效避免假阳性或假阴性结果的发生。

最后，该标准还列出了检疫鉴定报告所需包含的信息内容。其中，包括样品来源、检测项目、方法名称、检测结果和结论等方面。这些信息能够为苜蓿疫霉根腐病菌检疫工作提供重要参考。

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