GB/T37874-2019
核酸提取纯化方法评价通则
Generalrulesforevaluationofnucleicacidextractionandpurificationmethods
- 中国标准分类号（CCS）G00
- 国际标准分类号（ICS）07.080
- 实施日期2019-08-30
- 文件格式PDF
- 文本页数8页
- 文件大小451.97KB
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核酸提取纯化方法评价通则
国家标准 GB/T37874一2019 核酸提取纯化方法评价通则 Generalrulesfrevalatonfmueleieaeidexraetiamdpurifieatonm meth0ds 2019-08-30发布 2019-08-30实施 国家市场监督管理总局 发布 币国国家标准化管理委员会国家标准
GB/37874一2019 目 次 前言 范围 2 规范性引用文件 术语和定义、缩略语 基本要求 指标参数 6 评价方法
GB/37874一2019 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准由国家标准物质研究中心提出并归口
本标准起草单位:科学院北京基因组研究所、计量科学研究院
本标准主要起草人:孟庆妹、傅博强、胡松年、葛晓萌、谈听煜、牛春艳、毕小春
GB/37874一2019 核酸提取纯化方法评价通则 范围 本标准规定了核酸提取纯化方法评价的指标参数和评价方法
本标准适用于分子生物学实验室对于常规样本(新鲜样本)的核酸(基因组DNA与总NA)提取 纯化方法的一般性评价
本标准不适用于病毒核酸的提取,游离DNA的提取,陈旧样本、微量样本与高度降解样本核酸的 提取方法的评价,也不适用于在提取过程中通过添加外源DNA或RNA以提高提取效率的核酸提取方 法的评价
规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文
凡是不注目期的引用文件,其最新版本(包括所有的修订单)适用于本文件
件
1sO8655-2:2002活塞式容量测量器第2部分:活塞移液器(Piston-ope ratedvolumetricappa Part2;Pistonppettes) ratus一P 术语和定义、缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1.1 核酸nueleicacid 由核苷酸或脱氧核苷酸通过3',5'-磷酸二酯键连接而成的一类生物大分子
具有非常重要的生物 功能主要是贮存遗传信息和传递遗传信息
包括核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)两类
JJF12652010,定义4.42] 3.1.2 标准物质referencematerial 具有足够均匀和稳定的特定特性的物质,其特性被证实适用于渊量中或标称特性检查中的预 用途
JJF1001一2011,定义8.14] 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件
DNA:脱氧核糖核酸(DeoxyribonucleicAeid) EDTA:乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraaceticacid OD:光密度(OptiealDensity
GB/T37874一2019 RNA;核糖核酸(RibonucleicAcd TE;三羚甲基氨基甲炕-乙二胺四乙酸(Triearboxymethylaminomethane-Ethylenediaminetet raaceticacid Tris;三羚甲基氨基甲烧(Trishydroxymethylaminomethane) 基本要求 常规的用于分子生物学提取核酸的样本主要包括新鲜的动植物组织样本、细胞样本、血液样本、,睡 液样本和粪便样本等
宜选用新鲜样本进行核酸提取;若不能马上提取,应分装成小份,按照样本特性 与采集情况妥善保存
5 指标参数 5.1核酸完整度 5.1.1一般说明 核酸完整度表征提取过程中保持核酸一级结构(序列完整而不发生改变的程度
在核酸提取时应 尽量防止物理(剪切力、高温、化学因素索(强酸强碱)和生物因素(核酸酶)的破坏
根据试验条件和核 酸样品,可以选择琼脂糖凝胶电泳方法进行核酸完整度测定,根据条带位置和不同条带的荧光亮度分析 综合计算评价核酸的完整性
5.1.2DNA完整度 用琼脂糖凝胶电泳法检测,完整基因组DNA电泳结果为一条清晰明亮的条带,条带拖尾或者弥散 代表DNA有部分降解
5.1.3总RNA完整度 5.1.3.1真核生物总RNA完整度 用琼脂糖凝胶电泳法检测,真核生物完整的总RNA电泳结果为清晰的两条条带-28S和18S核糖 体RNA条带
28S和18S核糖体RNA条带清晰,且两条条带的荧光亮度比值(28S:18S)>1,以满足 后续试验的要求
5.1.3.2原核生物总RNA完整度 用琼脂糖凝胶电泳法检测,原核生物完整的总RNA电泳结果为清晰的两条条带-23S和16S核糖 体RNA条带
23s和16s核糖体RNA条带清晰,且两条条带的荧光亮度比值(23s:16S)>1,该完整 度可以满足绝大部分后续试验的要求
5.1.3.3总RNA降解 用琼脂糖凝胶电泳法检测,如果电泳条带弥散,没有清晰的核糖体RNA条带,为部分降解的RNA 样品;电泳条带呈现极低分子质量处的弥散状,为完全降解的RNA样品
5.2提取产量 提取产量是指单位样本中提取得到的核酸(DNA或RNA)的总质量
该指标用于表征提取得率
GB/37874一2019 采用微量紫外测定仪和/或微量荧光剂测定提取液中的核酸质量浓度(ng/AL),结合提取液体积计算提 取量,计算得率
计算公式与参考得率见6.2.3. 5.3核酸纯度 5.3.1 -般说明 核酸纯度是指核酸提取物中目标核酸的纯度,该指标用于表征核酸提取物中目标核酸与残留杂质 的相对含量,对于后续的分子生物学试验有重要的影响
核酸在特定波长的吸光度值及其在不同波长 吸光度值的比率对不同性质的核酸有对应的特征值,用以表征提取液的核酸纯度
用紫外分光光度计 测定260nm、280nm、230nm下提取液的吸光度OD.m.OD.m、ODm,计算OD./OD.丽和ODm OD.,表征核酸纯度
测量吸光度时,需调整核酸浓度,保证核酸吸光值OD在0.11.5之间
5.3.2DNA纯度 纯DNAOD.o/OD.丽为1.8,在DNA提取获得的产物中,OD.n/OD.在1.71.9表明DNA纯度 符合后续一般分子生物学试验需要
ODm/ODm>1.9时表明有RNA污染;OD,n/OD<1.7时表 明有蛋白质,多阶等污染
纯DNAODm/OD.n>2.0
ODm/ODn<2.0,表明有残存的盐或其他小 分子杂质
5.3.3RNA纯度 纯RNA的OD/OD为2.0,RNA提取溶液的OD/ODa在1.72.0表明RNA纯度基本可 以满足后续分子生物学试验处理需要
ODm/OD<1.7时表明有蛋白质或多盼污染;ODm/ODm>2.0 时表明可能有异硫酸残存
纯RNA的OD丽/OD.m>2.0
OD/ODn<2.0,表明有残存的盐或其他 小分子杂质
评价方法 6.1琼脂糖凝胶电泳法评价核酸完整度 6.1.1仪器和设备 6.1.1.1水平电泳仪
6.1.1.2凝胶成像系统;像素不低于130万
6.1.1.3微量移液器;应符合IsG8655-2;2002的要求， 6.1.2操作步骤 配制与核酸类型及电泳仪规格相匹配的琼脂糖凝胶; 取合适浓度的核酸样品溶液与核酸上样缓冲液混合; 电泳至合适位置; 用凝胶成像系统观察核酸条带 6.2荧光定量法评价核酸提取产量 6.2.1试剂和溶液 荧光定量试剂盒
GB/T37874一2019 6.2.2仪器和设备 6.2.2.1 荧光定量仪 灵敏度应达到10pg/L 6.2.2.2微量移液器 应符合ISO8655-2:2002的要求 6.2.3操作步骤 首先根据样品选择适当的标准物质校准荧光定量仪
标准物质在使用前需要现用现配(稀释),标 准物质与荧光染料充分混合后需孵育适当的时间(按仪器使用指南操作)
检测时取待测核酸提取纯化 样品与荧光染料混合均匀,室温孵化后检测荧光,回归曲线分析得到检测结果
为保证结果的准确性， 每个样品应重复检测三次,从与荧光染料的混合开始
然后根据式(1)计算核酸提取纯化产物产量
O XV 式中 Q 产量,单位为纳克(ng); -第i次荧光定量仪测得的核酸质量浓度,单位为纳克每微升(ng/L) p 测量重复次数 n 核酸溶液的体积,单位为微升(L)
6.2.4经验参考值 对于几种常见的生物样本,合格的核酸提取纯化方法的参考得率(最低标准)为 起始样品为100AL全血时,提取到的基因组DNA产量>14g,总RNA产量>500ng; 起始样品为1×10细胞时,提取到的基因组DNA产量>1g,总RNA产量>500ng; 起始样品为100mg新鲜植物叶片时,提取到的基因组DNA产量>14g,总RNA产量>500ng 6.3紫外吸光法评价核酸纯度 6.3.1试剂和溶液 核酸样品溶解液
6.3.2仪器和设备 6.3.2.1 紫外分光光度仪 波长范围:l90nm1100nm a b 波长准确度:士0.1 nm; 波长重复性:士0.1 nm
GB/37874一2019 6.3.2.2微量移液器;应符合1SO8655-2;2002的要求
6.3.3操作步骤 抬起仪器检测臂,加2AL蒸僧水清洁上下基座;吸取1AL核酸样品溶解液作为空白对照,检测空 白对照;吸取1A核酸样品测定样品溶液在2601 nm,280nm、230nm处的吸收值计算ODa/OD 80、 OD./OD的比值
每个样品重复测定3次,计算求得平均比值
核酸提取纯化方法评价通则GB/T37874-2019
在分子生物学和基因工程研究中，核酸提取和纯化是重要的实验步骤之一。为了保证核酸提取和纯化的准确性和可靠性，制定了一系列相关的技术规范和标准。其中，GB/T37874-2019《核酸提取纯化方法评价通则》就是针对核酸提取和纯化方法评价制定的国家标准。
该标准从样品类型、提取方法、纯化方法等方面入手，规定了评价方法和指标。主要包括以下内容：
- 核酸提取和纯化方法的选择和优化，根据不同的样品类型和实验要求选择合适的提取和纯化方法
- 核酸质量的评价，包括回收率、纯度、完整性等指标
- 试剂的选择和质量验证，包括试剂的来源、规格、性能等方面的验证
- 实验操作的规范和记录，包括实验材料的标识、操作步骤的记录等
通过以上评价指标和方法，可以全面、准确地评估核酸提取纯化方法的质量和可靠性。同时，在使用该标准进行核酸提取和纯化时，还需结合具体的实验需要进行选择和优化。
总之，GB/T37874-2019技术规范对核酸提取纯化方法的评价提供了科学、规范的方法和标准，对于保证实验结果的准确性和可靠性具有重要意义。
