猪流感病毒核酸RT-PCR检测方法

猪流感病毒核酸RT-PCR检测方法

国家标准 GB/T27521一2011 猪流感病毒核酸RT-PCR检测方法 RI-CRassyforswineinluenxavirusnueleieaeid 2011-11-21发布 2012-03-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T27521一2011 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由农业部提出 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口 本标准起草单位:农业科学院哈尔滨兽医研究所,检验检疫科学研究院,兽医药品监 察所 本标准主要起草人;乔传玲、韩雪清、杨焕良、刘业兵陈艳、吴绍强、陈化兰、林祥梅、辛晓光、朱中武、 王慧煜、刘建、李建、梅琳,王伊琴,徐彪、,阮周曦、宁宜宝、薄清如,秦智锋、林志雄
GB/T27521一2011 猪流感病毒核酸RT-PCR检测方法 范围 本标准规定了猪流感病毒核酸RT-PCR检测方法的技术要求 本标准规定的RTPCR检测方法适用于检测猪肺脏组织、鼻腔及气管分泌物和这些采集样品培养 物中的猪流感病毒核酸 缩略语 下列缩略语适用于本文件 ocarbonate) DEPC;焦碳酸二乙酯diethypyc 小NTP.脱氧核苷酸三磷酸(dcoxyribonueleosidetriphosphate) EB潦化乙锭(ethidiummbromide M\MLvRT;莫洛尼氏鼠白血病病毒反转录酶(nmooney murineleukemiavirusreversetran scriptase merasechainreaction PCR:聚合酶链式反应(polyn RNA:核糖核酸(ribonucleicacid RNAaseinhibitor;RNA酶抑制剂 chainreaction RT-PCR,反转录-聚合酶链式反应(reverse-transeriptionpolymerasec free SPF:无特定病原体(specifie aahogent Cpar TaqDNApolymerase:TuqDNA聚合酶 仪器 3.1PCR仪 3.2台式低温高速离心机 3.3电泳仪 电泳槽 3.5冰箱 3.6凝胶成像系统 微量移液器 水浴锅 试剂 4.1LsTRIzolRNA提取试剂或其他商品化的RNA提取试剂 4.2氯仿、异丙醇,无水乙醇 4.31.2%琼脂糖凝胶,见附录A中A.. 4.450×TAE缓冲液,见附录A中A.2
GB/T27521一2011 4.5溴化乙锭(EB,10g/L)或核酸染料,见附录A中A.3 4.6焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的灭菌双蒸水,见附录A中A.4 4.7DNA分子量标准(100bp) 4.8M-MLV反转录酶 4.9RNVA酶抑制剂 4.10 aqDNA聚合酶 4.11dNTP 4.12商品化的一步法RT-PCR反应试剂 含有RT-PCR缓冲液,酶混合物,dNTP混合物,无RNA 酶的水等 引物 5.1反转录引物见附录B中B.1 引物浓度为20pmol/aL 5.2PCR引物见附录B中B.2 引物浓度均为20pmol/al 6 样品对照 以灭活的猪流感病毒感染SPF鸡胚尿囊液或者感染动物的组织作为阳性对照,以正常SPF鸡胚尿 囊液或者正常动物组织作为阴性对照 操作步骤 样品的采集及处理 7.1.1 采样工具 下列采样工具应经121C士2,l5min高压灭菌并烘干 棉拭子; a b 剪刀; c)锻子; d)1.5ml离心管; e)研钵 7.1.2 活猪 取鼻拭子 采集方法如下;将棉拭子深人鼻腔旋转,取鼻腔分泌液;将采样后的拭子分别放人盛有 1.0mlPBS(见附录A中A.5)的1.5ml离心管中,加盖、编号 7.1.3病死猪 取肺脏或气管分泌物等 采集方法如下:用无菌慑子和剪刀采集肺脏等,装人一次性塑料袋或其他 灭菌容器,编号 7.1.4样品贮运 样品采集后,放人密闭的塑料袋内(一个采样点的样品放一个塑料袋),于保温箱中加冰,密封,24h 内送实验室
GB/T27521一2011 7.1.5样品处理 7.1.5.1棉拭子处理方法 样品在混合器上充分混合后,用高压灭菌镀子将拭子中的液体挤出,弃去拭子,室温静置30min. 4C、3000r/min离心15min.取上清液转人无菌的1.5mL离心管中,编号备用 7.1.5.2脏器处理方法 将所采组织病料置于洁净、灭菌并烘干的研磨器中,按质量体积比(1:1)加人样品保存液进行充分 研磨;4C,3000r/min离心15min,取上清液转人无菌的1.5ml离心管中,编号备用 7.2RNA的提取 7.2.1用LsTRLol试剂提取待检样品,阳性对照及阴性对照样品的RNA 7.2.2250L样品处理液和750LLsTRlzol置人一个1.5mL离心管,振荡数次,静置5min. 7.2. .3 加200L氯仿,振荡混匀,室温放置5min,4C12000r/min,离心15min. 7.2.4吸取上层水相至一新离心管中,加人等量异丙醉,混匀,室温放置15min,4C,120o0r/min离 心15min,离心后在离心管边和底部可见有胶样RNA沉诧(对于细胞毒而言,可能看不到沉淀) 弃 上清 7.2.5小心吸弃上清,加人500l75%乙醇(DEPC水配置),小心颠倒以漂洗沉淀及管壁,4C、 12000r/min,离心5nmin. 7.2.6小心吸弃上清,沉淀置室温条件下干燥后,加适量DEPC水溶解 7.2.7提取的RNA须在2h内进行RT-PCR扩增,若需长期保存,须放置一70C冰箱保存 7.2.8也可采用商品化的基因组RNA提取试剂,按照说明书进行操作 同时进行阴,阳性对照样品 RNA的提取 7.3RT-rCR 7.3.1 -步法反应操作步骤(如实验室有商品化的一步法RT-CR反应试剂采用此操作步骤 7.3.1.1在0.2ml反应管中依次加人 一步法RT-PCR缓冲液 10L dNTP(10mmol/I) 2.0L 酶混合物 2.0儿 RNA酶抑制剂 00 5 5AL 上游引物 0.5ml 下游引物 0.5l RNA模板 AL 5 DEPC水 29.5l 上述体系根据扩增目的片段不同,分别选择相应的M,HlHA、甲HlHA,H3HA,NINA及N2NA 单个基因的上/下游引物进行反应 采用CR仪立即进行RTPCR扩增 检测同时设立阴,阳性对照 7.3.1.2 7.3.1.3RT-PCR反应条件为;48C45min;94C2min;然后9430s,50C1nmin,68C2min 共40个循环;最后68C延伸7min 7.3.2两步法反应操作步骤(如实验室没有商品化的一步法RT-PCR反应试剂采用此操作步骤 7.3.2.1RT取5ALRNA,加1AL反转录引物(Unil2),70C水浴5 min
GB/T27521一2011 7.3.2.2冰浴2min,继续加人: 5×反转录反应缓冲液 4 l 0.1mol/几DTT 2L 2.5mmol/儿dNTPs 2 M-MLV反转录酶 5山 00 5 RNA酶抑制剂 0.5"l DEPC水 pl 5 7.3.2.337C水浴1h,合成ecDNA 取出直接进行PCR或置一20C保存 7.3.2.4根据扩增目的片段不同,选择相应的上/下游引物进行扩增 PCR体系包括 双蒸灭菌水 37.5l 反转录产物 4Al 上游引物 0. 5 Al 下游引物 0.5Al 10×PCRBuffer 5 '心 2.5nmmol/LdNTPs l Ta酶 0.5Al 首先加人双蒸灭菌水,然后再按照顺序逐一加人上述成分,每一次要加人到液面下 全部加完后 混匀,瞬时离心,使液体都沉降到PCR管底 7.3.2.5PCR反应条件为;95C预变性5min;94C变性45s,50C退火45s,72C延伸45s,循环 30次;72C延伸6min 扩增产物的电泳检测 制备1.2%琼脂糖凝胶板,见附录A中A.1 在电泳槽中加人1×TAE电泳缓冲液,使液面刚刚没 过凝胶 取3Al5AL扩增产物分别和适量加样缓冲液混合后,加到凝胶孔 加人分子量标准 恒压 110V)下电泳30min一40min,将电泳好的凝胶放到凝胶成像系统上观察结果 试验成立的条件 阳性对照的扩增产物经电泳检测,在预期大小的条带位置均出现特异性条带,阴性对照的扩增产物 经电泳检测均没有预期大小的目的条带 阴、阳性对照同时成立则表明试验有效,否则试验无效 10 结果判定 10.1阳性判定 应用引物M-684U/M-684L、H1-668U/H1-668L、甲-428U/甲-428L、H3-668U/H3-668L N1-615U/NI-615L、N2-246U/N2-246L,按照各基因检测体系对样品进行检测,扩增产物如果在 684bp,668bp,428bp,668bp,615bp,246bp位置出现特异性条带,则判定为猪流感病毒或相应亚型 病毒核酸阳性 10.2阴性判定 如果在所用引物预期扩增片段的位置均未出现特异性条带,则判定为猪流感病毒核酸阴性
GB/T27521?2011 ?A 淶?? ? A.11.2"%? ? l.2g 1TAE?? 100mL 100ml.TAE??(IX),???60C?,5pL?. ?,?3mm5mm A.250xTAE?? A.2.10.5mol/L?(EDTA)?pHH8.0 ?? 18.61g" 80m ?? pH8.0 ?? 100m A.2.2TAE??(50) 242g ??(Tris) 57.1mL 0.5mol/??(pHH8.0) 100mL ?? 1000mL ?????á 廯?(EB)? ?? 20 mg ?? 20mL A.4DEC? 100 ?? mL 50" ?(DEPC k ??,121C?15min,?1.5mLDEPC?? A.5Ps? A.5.1A? 0.2mol/L??
GB/T27521?2011 NaH.PoH.o27.6g,??,1000mL A.5.2B? 0.2mol/L?? NaeHPO7H.O53.6g(NaHPO12H.O71.6gNaHPO2H.O35.6g), ??,1000ml A.5.30.01mol/LplH7.2λ? 0.2mol/L.A? 4ml. 0.2mol/LB? 36mL NaCI 8.5g ??1000nml
GB/T27521一2011 附 录 B 规范性附录 物 B.1反转录引物 Uni12:5'-AGCAAAAGCAGG-3' B.2CR引物 引物名称 引物序列(5'3' 长度(bp) 扩增目的片段 M684U CAAGACCAATCCTGTCACCTc 684 猪流感病毒M基因 M-6841 AAGACGATCAAGAATCCACAA Hl-668U 668 猪流感病毒Hl亚型HA基因 Hl-668L 甲-428U 428 猪甲型HlNI流感病毒HA基因 甲-428L H3-668U 668 猪流感病毒H3亚型HA基因 H3-668L Nl-615U TTGCTTGGTCRGCAAGTGC 615 猪流感病毒N1亚型NA基因 N1-615 YCwGTCCAYCCATTWGGATCC N2-246U CAGTAGTAATGACTGATGG 246 猪流感病毒N2亚型NA基因 N2-246L CCTGAGCACACATAACTGGA

猪流感病毒核酸RT-PCR检测方法GB/T27521-2011

一、什么是猪流感病毒核酸RT-PCR检测方法GB/T27521-2011？

猪流感病毒核酸RT-PCR检测方法GB/T27521-2011是指按照国家标准GB/T27521-2011《猪流感病毒检测方法RT-PCR法》进行猪流感病毒核酸检测的方法，该方法通过特异性引物和探针放大病毒RNA，然后用荧光定量PCR技术进行检测，从而实现病毒的快速、准确检测。

二、猪流感病毒核酸RT-PCR检测方法GB/T27521-2011的优势

相比传统的病毒诊断方法，猪流感病毒核酸RT-PCR检测方法GB/T27521-2011具有以下几个优势：

• 快速：该方法可在短时间内获得准确的检测结果。
• 准确：该方法的特异性和敏感性非常高，能够针对不同亚型的猪流感病毒进行检测。
• 简便：该方法操作简单，可以批量化进行检测，提高了工作效率。

三、猪流感病毒核酸RT-PCR检测方法GB/T27521-2011的应用

猪流感病毒核酸RT-PCR检测方法GB/T27521-2011广泛应用于猪流感病毒的诊断和监测中，尤其是在疫情爆发期间，可以帮助相关单位及时掌握疫情动态，采取有效的防控措施。此外，该方法还可以用于病毒学研究、药物筛选等领域。

四、总结

猪流感病毒核酸RT-PCR检测方法GB/T27521-2011是一种可靠、快速的病毒诊断方法，具有操作简单、准确性高等优势，在疾控和临床实践中得到广泛应用和推广。

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