棉花皱叶病毒检疫鉴定方法

棉花皱叶病毒检疫鉴定方法

国家标准 GB/T318032015 棉花皱叶病毒检疫鉴定方法 DeteetionandidentificationofCottonleafcrumplevir4s 2015-07-03发布 2015-11-27实施 中毕人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中 国国家标准化管厘委员会国家标准
GB/T31803一2015 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口 本标准起草单位;检验检疫科学研究院、福建出人境检验检疫局、浙江大学、浙 江出人境检验检疫局 本标准主要起草人;张永江、雷荣、沈建国、周雪平,鲁洁、张明哲,李桂芬,朱水芳
GB/T31803一2015 棉花皱叶病毒检疫鉴定方法 范围 本标准规定了棉花皱叶病毒的免疫学及分子生物学检疫鉴定等方法 本标准适用于可能携带棉花皱叶病毒的活体寄主植物叶片组织的检疫鉴定 仪器设备、用具和试剂 2.1仪器设备 电子分析天平(0.001g)、小型离心机、台式冷冻离心机、恒温水浴锅、酶标仪、普通PCR仪,实时荧 光PCR仪、电泳系统、pH计、凝胶成像系统、4C冰箱、超净工作台、一80C超低温冰箱、高压灭菌锅、 制冰机、涡旋振荡器、,微波炉等 2.2用具 L、1000L),吸头、离心管,Eppendor管(o.2mL、 可调移液器(2.5Al、10L,20Al100 0.5mL、1.5mL)和研钵等 2.3试剂 除有特殊说明外,所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂 DAs-ELIsA、常规CR及实时荧光PCR检测试剂分别见附录B,附录c及附录D 检疫鉴定方法 3.1DAS-EL.IsA检测 DAS-ELISA检测见附录B 3.2常规PCR检测 常规PCR检测见附录C 3.3实时荧光CR检测 实时荧光CR检测见附录D 结果判断 3.1,3.2及3.3中两种不同原理的检测方法的结果为阳性,即可判定样品为CLCrV阳性 一般是 DASELISA检测为阳性后,常规PCR或实时荧光PCR检测结果为阳性即可判断样品为CICrV阳性
GB/T31803一2015 样品保存与记录结果 5.1样品保存 结果判定为阳性的样品应妥善保存,并做好登记和标记,以备复核用 保存期满后,需经灭活处理 5.2结果记录 完整的实验记录要包括;样品的来源,种类,时间,实验检测时间,地点,方法和结果,并有实验人员 的签字;DAS-ELISA检测需有酶联反应原始数据,PCR检测需有电泳结果图片,实时荧光PCR检测需 有扩增曲线结果图片
GB/T31803一2015 附录A 资料性附录 棉花皱叶病毒背景资料 A.1背景资料 A.1.1棉花皱叶病毒基本信息 中文名:棉花皱叶病毒 学名:Coonleafcrumbleirus 缩写:CLCrV 分类地位,双生病毒科(Gioninitiridr)菜豆金色花叶病毒属(brgoirn) 传播途径;烟粉虱(Bemisiatabaci)及苗木嫁接传播,机械接触、苑丝子(Cuscutasubinelasa),种子 及花粉不传播 A.1.2方法原理 根据棉花皱叶病毒与抗体之间的特异性反应,对样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附(DAsELISA) 检测;根据该病毒DNA保守区的特异性进行常规PCR或实时荧光PCR检测,通过电泳条带大小或扩护 增曲线的变化进行结果判定 A.2寄主范围 包括棉属(Gosypiwm),茴麻属(Abuilom),蜀葵属(Ahaea),木植属(Hibiscus),锦葵属(Malwa),栗豆 树属(Castam05ermum))、大豆属(Gycine)、菜豆属(Phaseolus)及巢菜属(Vicia)的一些植物 A.3分布 该病毒主要分布在印度、墨西哥,美国、危地马拉及中东地区 A.4病害症状 该病毒侵染棉花造成叶中脉组织增生、叶脉坏死或脉明,叶脉组织的叶肉部分偶尔出现红色小点 有时形成分散的泡斑;苞叶和花常畸形;叶柄弯曲,叶片向下卷曲并有明显的花叶 A.5粒体形态 nm20nm,二聚体长30nm32nm 病毒粒体双生,无包膜,直径为17 A.6基因组特征 该病毒具有Begomoeirus病毒典型的基因组,含有2条大小均为2.5kb3.0kb的单链闭合环状 DNA分子,即DNA-A和DNA-B;二者是棉花皱叶系统感染必需的 A和B共同区commen rIgOn" CR)的序列同源性相对较低
GB/T31803?2015 ? B 淶?? ???DAS-ELISA B.1?? B.1.1?? ?б??塣 B.1.2 ???塣 B.1.3?? ????塣 B.1.4 (pNPP) B.1.510PBST?(pH7.4) ?(N.c)80g.(KHHPo,2.(N.HPo)l.5.?(Kc26 -20(Tw yeen-20)5mL.,(HCI)pH7.4,1000ml,4档 B.1.6???(pH7.4 (NasO.)1.3g,??Mw2400040000,PVP)20g,(NaN) 0.2g-20(Tween-20)20mL,800mL1PBST,(HCI)pH7.4,1PBST 1000ml,4C档 B.1.7建?(pH9.6) ?(Na.cO.)1.59g?(NaHcO.)2.93g(NaN,)0,.2g,(HCI)pH 9.6,?1000mL.4C档 B.1.8??? 1PEST?HClpH7.4,4?档 B.1.9??建?(pl7.4 1PBsT?800mL???(EBSsA)2g,??(Mw24000?40000. PVP)20g(NaN,)0.2g,1PBST1000mL,4?档 B.1.10(pNPP)?(pH9.8 ?(CHNO.)97mL(NaN.)0.2g,(HCI)pH9.8,??
GB/T31803一2015 1000mL,4C条件下贮存 B.1.11底物(pNPP)溶液 将4-硝基酚磷酸钠盐(pNPP)100mg溶解于pNPP底物缓冲液100mL中,现配现用 B.1.12反应终止液 氢氧化钠(NaOH)40g,用燕僧水定容至1000mL B.2样品制备 取植物叶片组织0.2g~l.0g,按1:5(g/ml.)加人样品提取缓冲液,用研钵研磨样品,4000片离 心5min后吸取上清液待用 B.3操作步骤 B.3.1包被抗体 根据检测需要将适量的孔条放于酶联板架上,包括2个阳性对照孔、2个阴性对照孔、2个空白对照 孔和多个待检测样品孔,每个样品重复2次;每孔加人100L的包被抗体溶液,封口膜包好,37C孵育 2h4h(或4C冰箱过夜). B.3.2加样 将酶联板孔中溶液控干,用PBST洗涤3次,每次3min,然后在滤纸上扣干;将100l.待测样品溶 液加人到待检测孔中,对照孔中也各加人100L相应的对照 封口膜包好,37C孵育2h一3h(或 4"C冰箱过夜. B.3.3加酶标抗体 洗涤,步骤同B.3.2;用酶标抗体稀释缓冲液按照要求稀释酶标抗体,每孔加人100L酶标抗体游 液,封口膜包好,37C孵育2h4h B.3.4加底物 洗涤,步骤同B.3.2;每孔加人100L底物溶液,室温孵育0.5h2h 必要时每孔加人504L的终 止液终止反应 B.3.5读数 酶标仪405nm波长下检测各孔的吸收值并记录 B.4结果判定 B.4.1质量控制要求 空白对照孔和阴性对照孔OD值<0.15;阳性对照OD值/阴性对照OD值>2;同一样品的 OD值应基本一致
GB/T31803一2015 B.4.2结果判定 若满足不了B.4.1的质量要求,则不能进行结果判定 在满足了B.4.1的质量要求后,则按如下原则作出判定 样品OD值/阴性对照OD值明显大于2,结果判定为阳性; 样品OD值/阴性对照OD值在值附近,判为可疑样品,需重做一次或者用3.2或3.3方 法进行验证; -样品OD值/阴性对照OD值明显小于2,判为阴性
GB/T31803一2015 附录c 规范性附录 常规PCR检测 C.1试剂 c.1.1十六炕基三甲基澳化肢(CTAB)DNA提取缓冲液 十六婉基三甲基澳化胺(CTAB)4g,乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA2H.O,0.5mol/L)8mL,氧 化钠(NaCI)16.4g,lmol/1Tris-HCl20ml,琉基乙醉(CH,OS)4mL,加蒸僧水定容至200mL,调 pH至8.0,121"高压灭菌30min C.1.2十六婉基三甲基澳化胺(CTAB)沉淀液 十六炕基三甲基澳化胀(cTAB)1og,飘化销(N;c)A. g,加水定容至100ml,121?C高压灭菌 30min C.13高盐TE缓冲液 乙二胺四乙酸二钠(Na,EDTA2H,O),0.5mol!/I)0.02ml,氯化钠(NaCl)5.85g,1mol/1Tris HCl1mL,加水定容至100ml,调pH至8.0,121C高压灭菌30min 50xTAE电泳缓冲液(H8o) C.1.4 三羚甲基氨基甲烧(Tris)242g、冰乙酸(CH,O)57.1mL、乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA" 2H,(O)37.2g,蒸僧水定容至1000mL,用时稀释至1×TAE C.2引物 上游引物CICrV-Bf:5'CTccTATccTAATcTGGGCAAGACTG3'; 下游引物CI.CrV-Br:;5'-CGGTcCAAGAATGTATCAAGAGTAGTTGT-3' 用于扩增棉花皱叶病毒DNA-B组分保守区域长度约为636bp的片段 C.3核酸提取 分别称取阴性(健康)对照、阳性(染病)对照及植物叶片组织0.5g于液氮中研磨,加人1.5mL 65C预热的统基乙醇/CTABDNA抽提液,混匀后转人2ml，离心管中,于65C温浴1h,不时混匀 用等体积的三氧甲烧/异戊醇(24l1)抽提,室温下1000片离心10min,回收上清,加人等体积的 CTAB沉淀液,颠倒混匀,于65C温浴1h;10000尽离心5min,移出上清,用1.5mL高盐TE缓冲液 重悬沉淀,加2倍体积无水乙醉沉淀核酸;12000迟离心15min,70%乙醇洗涤;37丫干燥后溶于100l 双燕水中,一20C保存备用 注:或者按照等效DNA提取试剂盒进行操作
GB/T31803一2015 C.4rCR扩增 0.2ml.PCR管中加人10×PCRbuffer(含Mg+)2L,dNTPs(10mmol/L)0.6AL.,CLCrV-B及 CICrV-Br(均为104mol/L)各0.5L,2U/lTaq酶1Al,模板2l和ddH.O13.4AL 设置阳性 对照、阴性对照及空白对照 反应条件;94C5min;94C30s,59C30s,72C30s,30个循环;72C8min. C.5琼脂糖凝胶电泳检测 制备1%的琼脂糖凝胶,按比例混匀电泳上样缓冲液和PCR扩增产物,用DNAMarker作为分子 量标记,进行电泳分析 电泳结束后在凝胶成像仪的紫外透射光下观察是否扩增出预期的特异性DNA 条带,并拍摄记录 C.6结果判定 如果阳性对照出现约636bp的条带,检测样品、阴性对照和空白对照未出现特异性条带,可判定样 品为CLCrV阴性 如果阳性对照及检测样品出现约636bp的条带,阴性对照和空白对照未出现特异性条带,可判定 样品为CLCrV阳性
GB/T31803一2015 附录D 规范性附录 实时荧光CR检测 D.1主要试剂 DNA提取试剂见c.1 TaqManPCRMixture D.2引物和探针 上游引物CLCrVF1-579;5’-ACAGcCAcTGAATGTGAAAAGAGAA-3' 下游引物CICrVR1-725:5'-GTTcAGTcTTGccCAGATTAGGATA-3' 探针CICrVProbe:5'-FAM-GGAATTTAcAATGGccCACAACAcAGTAMRA-3 D.3核酸提取 操作方法见C.3 D.4实时荧光PCR反应 反应体系:0.2ml离心管中加人TaqManPCRMixture10L,CLCrV-F1-579(104mol/L 0.4L,CLCrV-R1-725(104mol/L)0.4l,CICrV-Probe(10Amol/L)0.4L,DNA模板2l.,补水至 20L 设置阳性对照、阴性对照及空白对照 反应程序:95C10min;95C15s,62C60s,共40个循环 注:PCR反应体系中各种试剂的量可根据具体情况进行适当调整,也可采用等效试剂盒 D.5结果判定 在空白对照及阴性对照无Ct值且无扩增曲线、阳性对照Ct值<30并出现典型扩增曲线的条 件下; 待测样品的Ct值>40时,判定CICrV阴性; -待测样品的Ct值<35时,判定cLCrV阳性; 待测样品的3540时,判定CLCrV 阴性;如果重新测试的C值<40,且分离曲线明显时,则判定CLCrV阳性

棉花皱叶病毒检疫鉴定方法GB/T31803-2015

棉花皱叶病毒是一种引起棉花急性黄化、皱缩和萎蔫的病毒，会导致棉花减产甚至死亡。为了防止病毒的传播，需要建立一套有效的检疫鉴定方法，准确判断棉花是否感染了该病毒。

根据国家标准GB/T31803-2015《棉花皱叶病毒检疫鉴定方法》，棉花皱叶病毒的检测主要分为样品采集、病毒RNA的提取、RT-PCR扩增和结果判定四个步骤。

第一步，样品采集。在棉花生长期间，从患病植株中采集叶片、茎部或花器官等组织，将其放入离心管中，加入液氮或冰醋酸乙酯保存，并及时送到实验室进行检测。

第二步，病毒RNA的提取。将样品组织经过粉碎后，利用 RNA 提取试剂盒提取其中的总 RNA，再通过纯化等操作获取病毒 RNA。

第三步，RT-PCR扩增。将病毒 RNA 模板通过 RT-PCR 扩增，得到相应的 PCR 产物，并通过电泳或其他方法进行鉴定。

第四步，结果判定。通过比对标准曲线、阳性对照和阴性对照等方法，确定扩增产物是否为棉花皱叶病毒。

总体来说，GB/T31803-2015所规定的棉花皱叶病毒检疫鉴定方法具有可靠、准确、快速等优点，能够有效地提高棉花种植业的检疫水平和抗病能力。

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2022/10/25 2:42:09 现行