牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光PCR检测方法

牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光PCR检测方法

国家标准 GB/T27981一2011 牛传染性鼻气管炎病毒实时 荧光PCR检测方法 Real-timePCRethodforthedeteetioof infeetiousbovinerhinotracheitisvirus 2011-12-30发布 2012-06-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T27981一2011 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准参考了OIE发布的《陆生动物诊断试验和疫苗手册》(2008版)关于牛传染性鼻气管炎/牛传 染性化脓性外阴阴道炎(Chapter2.4.13)的内容 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口 本标准起草单位:广东出人境检验检疫局、江苏出人境检验检 疫局 本标准主要起草人:陈茹、刘中勇、林志雄、罗琼、曾碧健、许如苏、姜巅、吴晓薇
GB/T27981一2011 牛传染性鼻气管炎病毒实时 荧光PCR检测方法 范围 本标准规定了牛传染性鼻气管炎病毒(牛庖疹病毒I型,BoHV-1)实时荧光PCR检测方法的技术 要求 本标准适用于快速检测牛血样、拭子、精液、动物组织(粘膜、肝、脾、肾、淋巴结、胎盘组织等)和细胞 培养物等样品中BoHHV-1病毒感染 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 世界动物卫生组织(OIE)《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册2008版关于检测牛冷冻精液 中BoHHV-1病毒的实时荧光PCR方法 缩略语 下列缩略语适用于本文件 e1,牛抱疹病毒I型 BolHV-1;bovineherpesvirustype C值;荧光信号量达到设定的阂值时所经历的循环数 DNA:deoxyribonucleicacid,脱氧核糖核酸 DTT DL.-dithiothreitol,二硫苏糖醇 EDTA:ethylenediaminetetraaceticacid,乙二胺四乙酸 lBR;bovineinfeetiousrhinotraeheitis,牛传染性鼻气管炎 PBs;phosphatebuffersolution,磷酸盐缓冲生理盐水 PCR;polymerasechainreaction,聚合酶链式反应 sDS;sodiumdodecylsulfate,十二烧基碱酸钠 UDG酶;uraeilDNAglycosylase,尿唁DNA糖基化酶 设备和器材 4.1荧光PCR仪 4.2台式冷冻离心机. 4.3可调微量移液器,规格10A.I00A.3200L.1nl 4.4带滤芯微量吸头;规格10L,100l,200AL、1mL 45PR光学反应管 4.6微量离心管 4.7涡旋混匀器 4.8恒温培养箱 4.9冰箱:规格2C8C,一20,一80C
GB/T27981一2011 4.10恒温水浴箱 试剂 除另有规定,本方法试验用水应按照GB/T6682中规定的二级水,所用化学试剂均为分析纯 5 引物与探针 引物与探针配制采用无DNA酶,无RNA酶水将每条引物与探针配制成100amol/L储存液,置 20C或更低温度冻存;使用时取适量配制成10Amol/1工作液,避免多次冻融 引物与探针序列 EB基因上游引物gBF.5'TGTGGAccTAAAccTcACGGT3" gB基因下游引物gB-R:5'GTAGTcGAGCAGACccGTGTC3” gB基因探针:5'[FAM]-AGGACCGCGAGTTCTTGCCGC[BHQ1]3” 探针5'端标记的报告荧光基团及3'端标记的钵灭基团可根据荧光PCR仪设备等具体情况另行 选定 5.2蛋白酶K溶液;配制方法见附录A 5.3柠檬酸钠缓冲液;配制方法见附录A 5.40.5mol/LEDTA;配制方法见附录A 5 0.01mol/LpH7.2PBS;配制方法见附录A 5.6 10%chelex100配制方法见附录A 5.71mol/LDTT;配制方法见附录A 5.8 定量PCR-UG酶预混液含60U/mL热启动Taq酶,40nmmol/LTris-HCIpH8.4). × mmol/1LKcl.6mmol/1.MgC!，400Amol/儿dGTP,400Amol/儿dATP,400Amol/儿dcCTP 100 800umol/L.dUTP,40U/mlUDG 可采用经验证可靠的商品化预混液 5.9核酸抽提试剂盒 10无DNA酶,无RNA酶水 11无水乙醇 5. 5. 1270%乙醇;用新开启的无水乙醇和无DNA酶、无RNA酶水配制.一20C预冷 5 13三氯甲烧 5.14异丙醇 样品采集与处理 6.1样品采集及前处理 采样工具 6.1.1 采样工具需经(121士2)C/0.1MPa高压15min并烘干,或经160干烤2h灭菌 6.1.2血清,全血 用无菌注射器或采血专用真空管针无菌自牛静脉采血,无菌分离血清,直接用于核酸提取 用无菌注射器或采血专用真空管针无菌自牛静脉采血,将血液直接滴人抗凝剂中,并立即连续摇 动,充分混合 抗凝剂采用柠檬酸钠缓冲液,或0.5mol/LEDTA 每6m血液加1ml抗凝剂 直 接用于核酸提取 6.1.3拭子 用无菌棉拭子采集鼻道、生殖器官和眼分泌物,采集时,将拭子反复刮擦呼吸道或生殖器官粘膜,蘸
GB/T27981一2011 取分泌物后,立即将棉拭子浸人1 2mL灭菌0.01mol/LpH7.2的PBS中,4C储存,尽快送达 n 实验室 取样进行检验时,充分振动、挤干拭子,浸泡液采用4000r/min离心1min,取上清备用 6.1.4精液 将冷冻精液样晶或新鲜精液样品分装到1.5mL微量离心管中,充分解冻后,振荡混匀,采用 12000r/min离心30s,取上清按6.2.1或6.2.3进行核酸提取;或取原液按6.2.2或6.2.3提取核 酸 每一批次冷冻精液取3支冻精管,分别进行核酸提取和后续检测 6.1.5组织样品 剖检时无菌采集动物呼吸道粘膜、扁桃腺、,肺部和支气管淋巴结,对流产胎儿,采集刚死亡胎儿肝、 肺、肾、脾和胎盘组织 检测时,用无菌剪、取适量样品,按1:5的比例加人灭菌0.01mol/LpH7.2 的PBs(例lg组织样品加5mL溶液),在研钵中剪碎,充分研磨,取研磨物分装到离心管中,冻融2次 3次.4000r/nmin离心5min,取上清备用 6.1.6细胞培养物 细胞培养物冻融2次一3次,分装到1.5mL.微量离心管中,4000r n离心1min,取上清备用 /min 6.2样品核酸抽提 6.2.1有机溶剂抽提法 适用于上述各种样品 取200L经前处理的样品或对照,加200AL.0.01mol/LpH7.2Ps缓冲 液,加sDs,蛋白酶K至终浓度分别为1%和0.5mg/mL,混匀器上振荡混匀,56C温育30min，置沸 水浴孵育8min;加等体积三氯甲炕烧,振荡混匀,12000r/min,离心10min,取上清;可重复三氧甲炕处 一次;加等体积异丙醉( 理步骤- -20预冷),振荡混匀;4C,13000r/min离心10min, ,弃上清;加等 体积70%乙醉,振荡混匀,4C,13000r/min离心10min;小心吸弃上清,吸头不要碰到有沉淀一面,倒 置于吸水纸上,尽量沾干液体(不同样品需在吸水纸不同地方沾干),在洁净工作台室温干燥5min;加 人50Al无DNA酶,无RNA酶水,轻轻混匀,溶解管壁上的核酸,室温放置10min,直接用于检测,或 贮一20C备用 长期贮存,应置一80或更低温度 6.2.2Chelex100提取法 采纳世界动物卫生组织(OIE)《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册》(2008版)操作程序,适用于精 液样品 在微量离心管中,加人10%chelex100溶液100AL,蛋白酶K(10mg/mL)11.5L,lmol/LDTT 7.5L..90儿L无DNA酶,无RNA酶水.,10L精液样品,充分混匀;置58C温育30min,充分振荡混 匀10s;置沸水浴孵育8nmin,充分振荡混匀10s;用12000r/min离心3min,取上清直接用于检测,或 贮一20C备用 长期贮存,应置一80C或更低温度 6.2.3试剂盒抽提法 可采用经验证等效的商品化核酸抽提试剂盒方法 实时荧光CR检测 7.1对照设立 7.1.1样品设置要求;从样品处理开始,应设置阳性对照、阴性对照 7.1.2阳性对照:取已知阳性的同类样品作为阳性对照 也可将适量BoHV-1病毒或含阳性模板的
GB/T27981一2011 质粒DNA添加到已知阴性样品中作为阳性对照样品 7.1.3阴性对照:取已知阴性的同类样品作为阴性对照 7.1.4空白对照:在扩增反应阶段设置 以无DNA酶,无RNA酶水作为模板设置空白对照 7.2实时荧光PCR检测 7.2.1加样 反应体系采用25Al反应体积,其中,含2×定量PCR-UDG预混液12.5Al.上、下游引物各 200nmol/L,探针100nmol/儿L,模板5AL(100pg1g),补加适量无DNA酶,无RNA酶水使反应总 体积达25Al 加完样后,盖紧管盖,混匀,低速瞬时离心,使反应液集中管底， 7.2.2扩增反应 反应参数设置 -50C2min; -95?C2min; 95c15s,60C45s,45个循环,荧光收集设置在每次循环的退火延伸时进行 荧光素或检测通道设置;采用FAM通道或将报告荻光(reportdye)设定为FAM,采用其他报告荧 光应按仪器说明对应设定通道;淖灭荧光(quenchdye)设定为None,校准荧光(referencedye)设定为 None 可根据不同品牌仪器说明等效设置参数 7.2.3结果判定 7.2.3.1结果分析条件设定 综合分析仪器给出的各项结果,基线(baseline)以仪器给出的默认值作为参考,值(threshold)设 定原则以闯值线刚好超过正常阴性对照样品扩增曲线的最高点为准,具体还需根据仪器噪声情况进行 调整,选择反应所设定的荧光基团对应的通道进行分析 7.2.3.2质控 阴性对照和空白对照应无Ct值,阳性对照的Ct值应<30且出现典型的扩增曲线 如对照不满足以上条件,此次实验视为无效 7.2.3.3荧光CR反应结果判定 在质控有效的条件下进行结果判定 阴性反应结果判定,检测结果呈现无Ct值的反应判为阴性反应 阳性反应结果判定,检测结果呈现Ct值<35且扩增曲线有明显的对数增长期,判为阳性反应 对于35GB/T27981?2011 ?A 淶?? ? A.10.01mol/LplH7.2PBs A?(0.2mol/L?);?(NaH,POH.(O)27.6g,??, 1L B?(0.2mol/L?);?(Na,HPO7H,O)53.6g(Na,HPO 12HH,O,71.6g;Na,HPO2H,O,35,6g)???,1L l4ml 0.2mol/1A? 0.2mol/LB? 36mL ? 8.5g A?B?,??,??1L,?0.01nmol/LpH7.2PBS ? A.2?? 5.3 (C,H,O;H,O) g (Na.,C,H,OH.(O) 15g 16.2" (CHO,H,O) ??,??,1L,?(121?2)C/0.1MPa?15min 4C A.30.5mo/LEDTA(p8.0) ?186.1gEEDTA,800ml??,??,(NaOH)pH 8.0,1L,?(121?2)/0.1MPa?15min,? A.410%ehelex100 ?10gchelex100?,??,100mL????? ? A.51mol/LTT ?3.09gDTT,20mL0.01mol/L(pH5.2)?,?,?С??20C 档 A.6?K?(10mg/mL ?100mg?K9.5ml.?,?,??K????? ??10mL
GB/T27981一2011 附 录 B 规范性附录 检测过程防止交叉污染的措施 B.1采样及样品处理过程,应防止不同样品之间通过器具、手套等的交叉污染 采样及样品处理工具 应经过高压灭菌或高温烘烤处理,一套工具仅限一个样品使用 存放样品的容器应清洗、高压灭菌或高 温烘烤处理,或使用一次性灭菌容器 B.2实验过程,应穿工作服和戴一次性手套,勤换手套,工作服应经常清洗 B.3使用带滤芯吸嘴 吸嘴,离心管,PCR管等应经过高压灭菌处理，一次性使用,不得回收清洗后重 复使用 B.4样品处理与PCR加样应在不同的区域进行,不同区域配备独立的加样工具和用具 该区域可以 是独立的空间间隔、有紫外消毒设施的独立的设备如核酸提取工作站、PCR加样工作站、可密闭进行紫 外消毒的超净工作台,生物安全柜等 若在敞开的空间进行核酸提取或PCR加样,该空间应安装紫外 灯或配备具有等同降解核酸功能的设备如移动紫外灯、带紫外消毒功能的空气消毒净化器等 上述区 min以上 每个区域应有专门的废弃物容 域在每次使用后应及时清洁处理,并在使用前后照射紫外30 器,该容器应能耐受煮沸,10%次氯酸钠溶液消毒处理 每次实验结束,应在紫外消毒前,及时清理废弃 物及消毒容器,并将该废弃物容器放回工作区进行紫外消毒 B.5PCR反应液等试剂应按检测需求分装贮存,避免同一管试剂多次开启使用 B.6装有核酸模板、样品或试剂的离心管在打开之前,应短暂离心,避免离心管用力崩开,所有操作尽 量避免产生气溶胶 B.7 上机运行前,应检查并盖紧各PCR管,以防荧光物质或模板泄漏而污染机器 B.8应遵循基因检测实验室其他技术要求

牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光PCR检测方法GB/T27981-2011

牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光PCR检测方法是一种高效、快速、灵敏和特异的检测方法，广泛应用于BRSV的监测和诊断。

该检测方法利用特异性引物和探针，通过扩增目标基因区域并进行荧光信号检测，能够在短时间内获得高度灵敏的检测结果。同时，该方法还具有高度的特异性，可避免与其他病原体的交叉反应，并能够准确鉴定BRSV感染。

在实际应用中，该方法的操作简单、快速、高效，可用于各种类型样本的检测，如血清、鼻拭子、支气管灌洗液等。同时，该方法还具有良好的重复性和稳定性，在不同实验室之间具有高度的可比性，是一种非常可靠的BRSV检测方法。

综上所述，牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光PCR检测方法是一种高效、快速、灵敏和特异的检测方法，已被GB/T27981-2011标准采纳。在BRSV的监测和诊断中具有重要的应用价值，为保障畜牧业生产和动物健康提供了有力的技术支持。

牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光PCR检测方法的相关资料

和牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光PCR检测方法类似的标准

GB/T27981-2011

牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光PCR检测方法

2022/10/27 16:44:45 现行