病毒性脑病和视网膜病病原逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测方法

病毒性脑病和视网膜病病原逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测方法

国家标准 GB/T27531一2011 病毒性脑病和视网膜病病原逆转录-聚合 酶链式反应(RT-PCR)检测方法 Protocolofreversetranseriptiompolymerasechainreaection(RT-PCR forthepathogenofviralemeephalopathyandretinopaty 2011-11-21发布 2012-03-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T27531一2011 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由农业部提出 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/Tc181)归口 本标推起草单位;深圳出人境检验检疫局 本标准主要起草人:刘瞠、卢体康、何俊强、史秀杰,郑晓聪、贾鹏、叶奕优、杨锦舜
GB/T27531一2011 病毒性脑病和视网膜病病原逆转录-聚合 酶链式反应(RI-PCR)检测方法 范围 本标准规定了病毒性脑病和视网膜病(viralencephalopathyandretinopathy,VER)病原分离和逆 转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测方法 本标准适用于VER病原的流行病学调查、诊断、检疫和监测 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出人境动物检疫采样 缩略语 下列缩略语适用于本文件 CPE:细胞病变(cytopathiceffect) CTAB:十六婉基三甲基漠化铵(hexadecyltrimethyammoniumbromide) DEPC;焦碳酸乙二酯(diethypyroearboate) EB;澳化乙锭(ethidiumbromide) EDTA;乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid HEPEs;羚乙基呱嗓乙硫磺酸[4-(2-hydroxyerhylpiperazine-1l-erhanesulfonicacid] RNA;核糖核酸(ribonucleicacid RNasin;核酸酶抑制剂ribonucleaseinhibitor) VER;病毒性脑病和视网膜病(viralencephalopathyandretinopathy) 试剂和材料 4.1水;符合GB/T6682中一级水的规格,用DEPC处理以除掉RNA酶 4.2VERV病毒参考株 4.3胰酶-EDTA混合消化液(见附录A中A.1) 4.4L-15培养液(见附录A中A.2). 4.5SSN-1细胞系;用L15培养液25C培养 4.6E-11细胞系:用L-15培养液25C培养 4.7AMV逆转录酶;20U/AL，一20C保存,不要反复冻融或温度剧烈变化 4.8RNasin;20U/L，-20C保存,不要反复冻融或温度剧烈变化 4.9胰蛋白酶
GB/T27531一2011 10Taq酶:一20C保存,不要反复冻融或温度剧烈变化 4. 4.11dNTP;含dCTP,dGTP,dATP,dTTP各10mmol/L 4.12引物;用于RT-PCR反应的引物浓度为40mol/L 其序列如下 VERV-F:5'-CGTGTCAGTCATGTGTCGCT-3 VERV-R:5'-CGAGTCAACACGGGTGAAGA-3 4.13乙醇;分析纯,使用前预冷到-20C 4.14氯仿;分析纯 4.15矿物油:要求无DNA酶和RNA酶,用于无热盖的PCR扩增仪 4.16分子量标准 器材和设备 5.196孔细胞培养板 5.2倒置显微镜 5.3恒温培养箱 5.4普通冰箱和超低温冰箱 5.5组织研磨器(研磨器处理参见附录B). 5 离心机和离心管(离心管处理参见附录B) .6 5.7PCR扩增仪 5.8水平电泳仪 5.9微量移液器及吸头(吸头处理参见附录B). 10紫外照射仪或凝胶成像仪 5. 5.11 制冰机 VERV的分离 6.1采样 待检测鱼,体长小于4cm的鱼苗取整条鱼,体长4cm~ 6cm的鱼苗取头部和内脏(包括肾),体长 大于6cm的鱼取脑、眼、脾和肾 按GB/T18088的标准采样 6.2样品处理 6.2.1组织处理 用组织研磨器制备组织匀浆,按1:10的最终稀释度用L-15培养液稀释,稀释液中含有1000IU/mL 青霉素和1000g/ml.链霉素,于15下孵育2h4h或4C下孵育6h一24h 7000r/min离心 15min ,收集上清液 6.2.2病毒分离 细胞传代使用胰酶-EDTA混合消化液 对1:10的组织匀浆上清液再作两次10倍稀释,然后将 1:10、1:100、l:1000的3个稀释度的上清液以适当体积分别接种到两个生长约24hSSN-1或E-11 细胞单层的96孔板中,每孔的细胞单层最多接种100l稀释液 1520吸附0.5h1h后,加 人L-15细胞培养液 两个96孔板分别置于20C和25C培养 设2个阳性对照(接种VERV标准 株)和1个空白对照(未接种病毒的细胞)
GB/T27531一2011 阳性对照和待测样品都接种细胞后,7d内每天用倒置显微镜检查 如果接种了被检匀浆上清稀 释液的细胞培养中出现细胞病变(CPE),应立即进行鉴定 如果除阳性对照细胞外,没有CPE出现,则 在培养7d后还要用敏感细胞进行盲传 传代时,将接种了组织匀浆上清稀释液的细胞单层培养物冻 融一次,以7000r/min、4笔离心15min,收集上清液 将上清液接种到新鲜细胞单层,培养7d 每天 用倒置显微镜检查 如果阳性对照也未出现CPE,则应换用ssN-1或E-11细胞和待测样品重新进行病毒学检查 VERV的RT-CR检测 7.1样品处理 将450L细胞病变悬液冻融后,放人1.5mL的塑料离心管,再加人450l.cTAB溶液(见附录A中 A.3)并混匀,25C作用2h 7.2核酸抽提 在含有样品的塑料离心管中加人600L抽提液1(见附录A中A 4),用力混合至少30s 12000 r/min离心5min,小心取上层水相(约800L) 再加人700L抽提液2(见附录A中A.5). 用力混合至少30s 12000r/min离心5min,小心取上层水相(约600Al 再加人一20C预冷的 1.5倍以上体积的无水乙醇,倒置数次混匀后，一208h以上沉淀核酸 12000, r/min离心30 min" 小心倒去上清液,倒置于吸水纸上,吸干液体 37干燥20min 或抽真空干燥;最后加10AL.水溶解 后,作为PCR模板 7.3变性和退火 在PCR管中加人10L模板和》L引物(VERV-下和VERV-R各2.5AL),置于70C反应 5min 立即冰浴,低速离心约5s,使液体集中在底部 7.4eDNA合成 在上述反应管中继绩加人dNTP2AL.5倍逆转录酶缓冲液5AL.RNA抑制剂1AlL.逆转录酶 1Al,无菌燕僧水1.5L,低速离心后,覆盖50AL矿物油 将PCR管置于PCR扩增仪 4260min反应制备模板的cDNA 反应结束后,7010min灭 活逆转录酶,立即冰浴 7.5PCR扩增 在上述反应管中再继续加人Taq酶1AL,dNTP1l,反向引物和正向引物各1Al,25mmol/L 的MgCL.见附录A中A.6)10nL,10倍Ta酶缓冲液(见附录A中A.7)10aL、加水到总体积 100L 混匀后低速离心,让矿物油在上层 再将反应管置于PCR扩增仪 先94C4min,再开始35次 循环(核酸变性94C1min、引物退火581min,延伸72C1min),然后72C下延伸10min,最后 4C保温 7.6设立对照 7.6.1在7.2中的样品处理过程中应设立阳性样品对照、阴性样品对照、空白对照 7.6.2取含有已知VERV的病毒标准株的病鱼组织悬液作为阳性对照 7.6.3采用未接种病毒的正常SSN-1细胞抽提核酸作为阴性对照
GB/T27531一2011 7.6.4取等体积的水代替模板作为空白对照 7.7琼脂糖电泳 用TBE(见附录A中A.8)电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖(含14g/mlEB,见附录A中A.9)平 板 将平板放人水平电泳槽,使电泳缓冲液刚好淹没胶面 将6lPCR扩增产物和2l澳酚蓝指示 剂溶液(见附录A中A.10)混匀后加人孔内 在电泳时使用核酸分子量标准参照物作对照 5V/cm 电泳约0.5h,当嗅酚蓝到达琼脂糖凝胶的底部时停止 7.8结果判定 用紫外照射仪或用凝胶成像仪观察扩增带并判断结果 7.8.1 如阳性对照出现一条427bp的DNA 片段,阴性对照和空白对照没有该扩增带,则表明反应体系正常 待测样品电泳后在相应427pDNA位置上有带者,取CR扩增产物进行测序,同参考序列 7.8.2 参见附录C)进行比较,相似性达到95%以上,则判定为阳性
GB/T27531?2011 ?A 淶?? ? A.1?-EDTA? (NaCI, 0.8g ?(KCI, 0.02 g 0.02 (KH,PO, g (K.HPO, 0.115 g ?(EDTA, 0.02 ?( 0,l 100 ?? ml ??á A.2? L-15,??,?10%???,?,4C档??? ?,??HEPES,??е??0.02mol/L A.3C'TAB? 2%CTAB,1.4mol/LNaCI,20.0mmol/LEDTA,20.0mol/LTris-HClpH7.5?? ????0.25% A.4?1 /?/?,1.0mol/LpH(7.9?0.2)Tris?:?:?25:24:1 ?,????档 ?2 /?,???24:1?,????档 6 MgC A 25.0mmol1 T?10?? Tris-HC 500.0mmol/LpH8.8
GB/T27531一2011 KCIl 500.0mmol/ TritonX-100 % A.8TBE电泳缓冲液(5倍浓缩液 Tris 54.0g 砌酸 27.5g EDTA 2.9 9g 1000.0ml 加水到 用5.0mol/L的HCl调pH到8.0 A.9EB 用水配制成10.0mg/mL的浓缩液 用时每10.0ml电泳液或琼脂中加1.0AL A.10澳酚蓝指示剂溶液(6倍上样缓冲液) 澳酚蓝100mg,加双蒸水5mL,在室温下过夜,待溶解后再称取蔗糖25g,加双燕水溶解后移人澳 酚蓝溶液中,摇匀后定容至50mL,加人NaOH溶液1滴,调至蓝色
GB/T27531一2011 附 录 B 资料性附录 耗材去RNA酶的处理方法 本方法适用于本标准中所使用的研磨器、离心管和吸头 使用前于180C干燥8h以上,或用0.1%DEPC水浸泡处理 DEPC处理时,先在37C浸泡2h 然后用灭菌水漂洗数次,于100C干烤15min,去除器皿上残余的DEPC
GB/T27531一2011 附录 C 资料性附录 扩增产物参考序列(sINV基因型,GenBank接收号;D30814) cgtgtcagtcatgtgtcgctggagcgttcgccttagtgtcccgtcccttg 51 agacacctgaggacaccaccgctccaattactacccaggcgccactccac 101 TT" aaCgattcCattaaCaaCggttacactggatttCgttcca 151 ctcgacccaactcgacctcgctcctgcaaa 201aacegttgce 251gtgtaetggeacctgcagaagaaagctggagacacteag 301gtactttgactggggactgtgggatgactt 351gggcgccctactactccgaccagcaaccacggcaaatcttgetgceggct 401ggcacgctcttcacccgtgttgactcg

病毒性脑病和视网膜病病原逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测方法GB/T27531-2011

病毒性脑病和视网膜病是由多种病原体引起的神经系统疾病，严重影响人们的健康和生命安全。为了及时、准确地诊断这些疾病，需要使用高灵敏度、高特异性的检测方法。目前，逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测方法被广泛应用于病毒性脑病和视网膜病的诊断。

RT-PCR是一种能够从RNA模板合成cDNA并扩增目标DNA序列的技术。该技术具有高度灵敏性和特异性，能够检测非常低浓度的RNA分子，并且能够鉴定目标DNA序列。

GB/T27531-2011是一项逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测方法的标准，该标准规定了病毒性脑病和视网膜病等神经系统疾病的检测方法。根据该标准，需要首先提取样本中的RNA，然后使用逆转录酶将RNA转化为cDNA，最后进行PCR扩增。

RT-PCR在病毒性脑病和视网膜病的诊断中具有很大的优势。它可以识别不同类型的病原体，并快速、准确地检测出病原体的存在。此外，该技术还可以对病原体的变异进行检测，从而更好地指导治疗。

总之，逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测方法是一种高度敏感、高度特异的检测方法，被广泛用于病毒性脑病和视网膜病的诊断。GB/T27531-2011标准进一步规范了该技术的应用，提高了检测结果的准确性和可靠性。

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