TaqDNA聚合酶

TaqDNA聚合酶

国家标准 GB/T35542一2017 TaqDNA聚合酶 IaqDNApolyerase 2017-12-29发布 2018-07-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/35542一2017 目 次 前言 引言 范围 2 规范性引用文件 术语和定义 技术要求 5 检验方法 包装、运输和贮存 保质期 附录A规范性附录TaqDNA聚合酶酶活检测 附录B规范性附录核酸外切酶检测 附录C规范性附录)核酸内切酶检测
GB/35542一2017 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由全国工具酶标准化工作组(SAC/SwG1l)归口 本标准起草单位:农业大学、厦门致善生物科技股份有限公司、福建华灿制药有限公司,福建南 生科技有限公司、厦门大学、华灿南生(厦门)生物技术有限公司、北京化工大学、海狸纳米科技(苏州)有 限公司、安琪酵母股份有限公司、复旦大学,山东大学,福建农林大学、苏州大学、上海百赛生物科技有限 公司、上海博仕生物科技有限公司 本标准主要起草人;宋娜杰、黄发灿、郑登忠、何昌华、詹学雄,李全宏、李庆阁、赵晶、陈劲春 陈秀兰、姚鹃、张熙颖、刘斌、钟江,黄发喜、任辉、邢志刚,朱力,邓丽君、刘佩,章丽丽
GB/T35542一2017 引 言 TaqDNA聚合酶是一种耐热酶,来源于重组大肠杆菌,含有从The 细菌克隆的全 erm4saquaticus 长TaqDNA聚合酶基因,分子质量为85ku 温度为55C110C时催化DNA的复制,74C75 为最适温度 制定TaqDNA聚合酶国家标准,用以推动该类工具酶的产业化,对于TaqDNA聚合酶 的生产和使用具有重要的意义 IN
GB/35542一2017 IaqDNA聚合面 范围 本标准规定了TaqDNA聚合酶的技术要求、检验方法,包装、,运输、贮存和保质期 本标准适用于从重组大肠杆菌中提取的TaqDNA聚合酶 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T191包装储运图示标志 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 TaqDNA聚合酶 -种耐热酶,分子质量为85ku,来源于重组大肠杆菌,含有从Thermusaquaticu细菌克隆的全长 TaqDNA聚合酶基因 温度为55C110时催化DNA的复制,74C一75C为最适温度 3.2 IaqNA聚合酶活性单位 以合成的发夹型寡核苷酸序列作为模板/引物,在74C,8min内,将1.17nmol脱氧核苷酸聚合成 双链DNA中所需的酶量为1活力单位(U) 技术要求 4.1产品外观 澄清透明液体,无沉淀 4.2酶活 >5000U/mL 4.3杂质 不应含有核酸外切酶和核酸内切酶 5 检验方法 5.1外观 直接或将样品倒人无色透明试管中,在自然光条件下,肉眼观察
GB/T35542一2017 5.2酶活 依据附录A的方法进行检测 5.3杂质 5.3.1核酸外切酶检测 依据附录B的方法进行检测 5.3.2核酸内切酶检测 依据附录C的方法进行检测 6 包装运输和贮存 6.1包装 内包装材料应洁净无污染,封口应严密,无泄漏 外包装箱储运图示标志应符合GB/T191的 规定 6.2运输 产品应在冷冻条件下运输,运输工具应清洁卫生、干燥,并有防雨,防晒设施,运输过程中应做好盼 护措施避免倒置及破损 不宜与有毒、有害、有异味物品混运 6.3贮存 应在温度低于一20C的条件下储存 保质期 在符合本标准规定的条件下,包装完好未启封的产品保质期为3年;超过保质期,使用前应检测 酶活
GB/35542一2017 附录 A 规范性附录) TaqDNA聚合酶酶活检测 A.1仪器设备 全自动医用PCR分析系统 A.2试剂 A.2.1发夹型寡核苷酸序列(T2),序列为 ecTGcTcccGcGGccGatctgccGGccGcGGGAGcA3 5'- -tagcgaaggatgtgaacctaatccc A.2.2dlNTP 注:包括dcTP,dATP,diIP,dGTP A.2.3PrcoGreen染料 A.2.4L.ambdaDNA标准品 A.3试剂溶液配制 A.3.11×TE溶液;10mnmol/儿Tris-HcCI,lmmol/1EDTA2Na,pH8.5(25C) A.3.2PCRbufer;250mol/LTris-HCl,50mmol/I.NH4)sO,500mmol/儿LKCl,1%体积分 数Tritonx-100,pH8.5(25C) .3.3L.ambdaDNA预染液;以8.5AL;1AL;0.5L的比例分别量取纯化水、10×PCRbufer和 A PicoGreen染料加人EP管,在漩涡混匀器上振荡混匀1min后在微型离心机上离心数秒,储存于2C A.3.4MgCl溶液;25mmol/L.MgCl 6H.o A.3.5酶稀释缓冲液:l0mmmol/LTris-HCl,0.1mmmol/LEDTA2Na,1mmol/LDTT,50%体积 分数甘油,pH8.0(25) A.3.6T2溶液;将发夹型寡核苷酸序列(T2)干粉按照合成单上的说明稀释到100mol/L,储存于 -20.使用时从-一20取出平衡至室温于漩涡混匀器上混匀10s,在微型离心机上离心数秒 .3.7dNTP混合液;将dNTP中的dCTP,dATP,dTTP,dGTP等体积进行混合,于漩涡混匀器上混 A 匀10s,在微型离心机上离心数秒,配制成浓度为25mmol/L的dNTP混合液 .3.8L.ambdaDNA标准品溶液;使用1×TE溶液将L.ambdaDNA标准品进行4倍连续梯度稀释" A 得到1004g/mL、254g/mL、12. 4g/mL、6.254g/ml、3.1254g/mL、1.562 和 从g/ml 0.781254g/mL.8个浓度梯度溶液,以相同体积的1×TE溶液作为背景对照 各梯度溶液和背景对照 分别加人等体积的预染液,于漩涡混匀器上混匀10s,在微型离心机上离心数秒,以20L/管分装于 rCR八联管内,每个梯度3个重复,盖紧管盖,在微型离心机上离心数秒后备用 A.3.9TaqDNVA聚合酶梯度稀释溶液;根据标定的酶比活力,使用酶稀释缓冲液对TaqDNA聚合酶 进行适当稀释(如标定浓度为5000U/mL，即5U/AL，则可2倍稀释,得到2×、4×,8×、16×的梯度 稀释液) 该步骤应在冰上进行
GB/T35542一2017 A.4实验步骤 A.4.1聚合反应液的配制与分装 A.4.1.1在EP管中按照表A.1的比例配制聚合反应液(冰上配制)聚合反应液配制完成后,在漩涡混 匀器涡旋混匀10s,微型离心机离心数秒 注:配制总体积计算见式(A.l): 总体积=[3×(n十1)十1]×V (A.l 式中; -重复次数; -TaqDNA聚合酶稀释梯度 前一个“1”表示空白对照数,后一个“1”表示预留损失数量; V， 1个反应用量,见表A.l 表A.1聚合反应液配比 聚合反应液组分 ！个反应用量/儿L. 规格 纯化水 15.2 PCRbuffer 10 25nmmol/L MgC溶液 T2溶液 1004mol/I 0.1 dNTP混合液 25mmol/1 0.2 Pieo(Green 0.5 A.4.1.2将A.4.1.1中的聚合反应液平均分装到n个(为TaqDNA的稀释梯度数)EP管中,分别加 人1.3l的各浓度梯度的TaqDNA聚合酶梯度稀释溶液和空白对照(酶稀释缓冲液),在漩涡混匀器 涡旋混匀10s,微型离心机离心数秒 各管混合液以20L/管,分装于PCR八联管内,每管混合液3个 重复,盖紧管盖,在微型离心机上离心数秒后备用 A.4.2运行程序 在全自动医用PCR分析系统上设置如下温度程序 C 16s 71 荧光采集通道:SYBR 120cycles 将装有LambdaDNA标准品和聚合反应液的PCR八联管置于全自动PCR分析系统中,启动温度 程序,开始聚合反应 A.5数据分析 A.5.1LambdaDNA标准曲线的制作 使用全自动医用PCR分析系统的软件打开数据,导出Excel文件 选取Excel文件中LambdaDNA标准品和背景对照的第30cycles的荧光值 计算背景对照3个 重复的平均荧光值,将各梯度LambdaDNA标准品的荧光值减掉背景对照的平均荧光值,得到净荧光
GB/35542一2017 值 计算各梯度净荧光值的平均值和标准偏差SD 以LambdaDNA标准品DNA量(ng)为X轴,以 各梯度净荧光值的平均值为Y轴,标准偏差SD为Error值进行多项式拟合分析,制作工作曲线,从中 获得净荧光值与双链DNA浓度的关系曲线如下,R>0.98: A.2 y=A十B 式中 -荧光值; -双链DNA的量,单位为纳克(ng). A.5.2聚合反应新生成的双链DNA量的计算 选取Excel文件中待检TaqDNA聚合酶的第30cycles的荧光数据 首先计算空白对照3个重复 的平均荧光值,将各梯度TaqDNA聚合酶的荧光值减掉空白对照的平均荧光值,得到净荧光值,计算 各梯度净荧光值的平均值(y 将各净荧光值代人式(A.1)计算聚合反应新生成的双链DNA量 A.5.3各IaqDNA聚合酶梯度条件下的dNTP消耗量计算 各T叫DNA聚合南梯度条件下的daNTP消耗量以 表示,单位为纳摩尔(nmol),按式A.3 计算 A.3 y？ ×324.5 式中: -新生成的双链DNA量,单位纳克(ng); Z 双链DNA由2条单链DNA组成; 324.5 -dNTP的相对平均分子质量 A.5.4IaqDNA聚合酶活计算 TaqDNA聚合酶酶活以S表示,单位为U/ml 选择在0.024nmol~0.166nmol范围内的dNTP 消耗量按照式(A.4)计算 y+0.03)×D S A.4 0.24 式中 dNTP消耗量,单位纳摩尔(nmol); y2 D 酶的稀释倍数
GB/T35542一2017 附 录 B 规范性附录) 核酸外切酶检测 B.1原理 ccepUC19所含经BamHI位点居于编码L.acZ的a互补肽上,ccepUC19经BamHI酶切后,由 环形DNA结构形成稳定的具有至黏性末端的双链DNA,其末端突出部分由五个碱基形成单链,极易 受核酸外切酶作用 若样品存在核酸外切酶时,黏性末端易受外切酶切割,再经T4DNA连接酶连接 其电泳条带位置不一致 B.2仪器和设备 B.2.1恒温水浴槽 B.2.2台式离心机 B.2.3超净工作台 B.2.4电泳仪 B.3材料 B.3.1高纯cccpUC19DNA B.3.2T4DNA连接酶 B.3.3氯仿-异戊醉(24:1,体积比). B.3.4琼脂糖 B.4实验步骤 B.4.1长时程过量酶切 各取54g高纯ccepUC19DNA置于两只eppondorf管,分别标记阴性对照和测试管，在阴性对 照管里加人10L10×BamHI缓冲液,2L限制性内切酶BamHI(10U一20U)，加人纯化水至 100AL;在测试管里加人10L 10×BamHI缓冲液,24L限制性内切酶BamH110U20U). 5LTagDNA聚合酶样品(50U~100U)，加人纯化水至100L 混匀，37C水浴10h,各取出 20AL,分别标记1,2号,待电泳检测;再各取20AL,分别标记3,4号 B.4.2电泳 鼓.42.1取出1号和2号管,加人载样缓冲液,准备电泳检测， B.4.2.21%~1.5%琼脂糖,电泳电压5V/cm10V/cm,当溴酚蓝线到达凝胶板2/3时停止电泳,取 出凝胶板置于紫外透光分析仪观察和拍照
GB/35542一2017 B.4.3连接 B.4.3.1回收NA 取出3、4号管,各加人20L氧仿-异戊醇先脱去杂蛋白,再沉淀出DNA,并真空干燥样品 B.4.3.2连接反应 每管加人2AL.l0×T4DNA连接酶缓冲液,2UT4DNA连接酶，加人纯化水至20L，混匀 15水浴8h B.4.3.3电泳 B.4.3.3.1取出3号和4号管,加人载样缓冲液,准备电泳检测 B4.3.3.21%1.5%琼脂糖,电泳电压5V/cm10V/cm,当溴酚蓝线到达凝胶板2/3时停止电泳， 取出凝胶板置于紫外透光分析仪观察和拍照 B.5结果判定 在电泳板上,肉眼观察 若1号和2号的谱带一致.3号和4号的谱带一致,则判定样品中不含楼 酸外切酶;若1号和2号的谱带不一致或(和)3号和4号的谱带不一致,则判定样品中含核酸外切酶
GB/T35542一2017 附 录 规范性附录) 核酸内切酶检测 C.1原理 pUC19质粒为环状结构,核酸内切酶能破坏环状结构,两者电泳谱带不一致 c.2仪器 C.2.1电泳仪 C.2.2分析天平(万分之 c.2.3紫外透光分析仪 c.3实验步骤 C.3.1pUc19质粒反应 C3.1.1在测试管里先后加人4L.pUC19质粒DNA(14g/pL),14L纯化水、2L酶,振荡器混匀. 水浴1h; C3.1.2在对照管里先后加人4ALpUC19质粒DNA(1"g/L)、16AL纯化水,振荡器混匀,水浴 1h C.3.2电泳 1%1.5%琼脂糖凝胶,电泳电压5V/cm~10V/cm ,当嗅酚蓝线到达凝胶板2/3时停止电泳,取 出凝胶板置于紫外透光分析仪观察和拍照 C.4结果判定 在电泳板上,肉眼观察 若测试管和对照管的谱带一致,则判定样品中不含核酸内切酶;若不一致 则判定样品中含有核酸内切酶

TaqDNA聚合酶GB/T35542-2017

在分子生物学中，TaqDNA聚合酶是一种被广泛应用的酶。TaqDNA聚合酶可以在PCR反应过程中扩增DNA序列，并且因为其高度稳定的性质，在PCR反应中起着至关重要的作用。

TaqDNA聚合酶最初是从热温菌（Thermus aquaticus）中分离出来的，这是一种生活在温泉中的细菌。由于该细菌生活在高温环境下，TaqDNA聚合酶具有非常强的抗热性，使其能够在高温条件下工作。

TaqDNA聚合酶的主要作用是将DNA单链模板复制成DNA双链产物。在PCR反应中，TaqDNA聚合酶会结合到DNA模板上，将其复制成DNA双链产物。该过程需要大量的核苷酸三磷酸（dNTPs），并且需要一个适当的反应温度和缓冲液。

近年来，关于TaqDNA聚合酶的标准化也变得越来越重要。根据国家标准GB/T35542-2017，TaqDNA聚合酶的使用和检测方法已经被明确规定。该标准不仅规定了TaqDNA聚合酶质量的要求，还规定了其检测方法和使用方法。

总之，TaqDNA聚合酶是PCR反应中必不可少的核心组成部分。在实验室中，我们需要严格按照相关标准来使用和检测TaqDNA聚合酶，以确保实验结果的准确性和可靠性。

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