GB/T26618-2011
派琴虫病诊断操作规程
ProtocolofdiagnosisforPerkinsosis
- 中国标准分类号（CCS）B41
- 国际标准分类号（ICS）11.220
- 实施日期2011-11-01
- 文件格式PDF
- 文本页数10页
- 文件大小578.36KB
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派琴虫病诊断操作规程
国家标准 GB/T26618一2011 派琴虫病诊断操作规程 ProtoeolofdiagnosisforPerkins0sis 2011-06-16发布 2011-11-01实施 中华人民共利国国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T26618一2011 前 言 本标准的附录A为规范性附录,附录B和附录C为资料性附录
本标准由农业部提出 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口
本标准起草单位检验检疫科学研究院、福建出人境检验检疫局、黄岛出人境检验检疫局、国家 海洋环境监测中心,深圳出人境检验检疫局、上海出人境检验检疫局
本标准主要起草人:吴绍强、林祥梅,刘建、郑腾,李西峰、梁玉波、刘辈、李建、韩雪清、贾广乐,梅琳
GB/26618一2011 引 言 派琴虫病是影响世界贝类养殖业发展的主要寄生虫病,为国际兽医局(OIE)规定的必报水生动物 疫病之一
本病1946年首次报道，当时,引起美国路易斯安那州的墨西哥海湾的大批牡蛎(CGyas ra.SSosrrea uirginica)死亡
迄今为止,已发现派琴虫存在于美洲、欧洲,澳洲,亚洲和非洲五大洲的许多贝类体内， 包括牡蛎、鲍鱼、蛤子、扇贝、珍珠牡蛎、鸟蛤和贻贝等体内,并在许多地区造成了严重的危害,死亡率高 达95%
1997年,我国在带孔扇贝、虾夷扇贝、皱纹盘鲍、菲律宾蛤仔体内检测到派琴虫
美国2005年也从 广西北海进口牡蛎中检出派琴虫
目前,派琴虫已经成为影响我国贝类养殖业发展的主要病原之 据对黄海北部三个海域的非律宾蛤任的派琴虫感染状况进行调查的结果表明,除3月份和6月份 的感染率分别为95%和90%之外,其他月份感染率均为100%
目前,派琴虫感染的诊断通常依靠oE推荐的组织切片法、FTM组织培养法以及CR方法
组 织学方法可以通过显微镜下直接观察虫体或观察组织损伤来监测感染的分布情况
FTM培养派琴虫 休眠袍子的方法是将派琴虫滋养体进行培养,培养后,虫体体积增大、细胞壁增厚,而且不繁殖,是一种 传统有效的定量检测派琴虫的方法
实时荧光PCR检测贝类派琴虫的方法敏感度较高,而且特异性 强,检测可在一天之内完成,定量准确,全封闭反应等优点
GB/T26618一2011 派琴虫病诊断操作规程 范围 本标准规定了派琴虫病诊断时的样品采集,虫体培养及显微镜检查,PCR以及荧光PCR检测操作 规程
本标准适用于蛤仔、牡蛎等水生动物及其产品中携带海洋派琴虫(Perkinsusmarinus),奥尔森派 琴虫(Perkinsusolseni)等派琴虫的诊断,也可用于派琴虫病的监测和流行病学调查
规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款
凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本
凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出人境动物检疫采样 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准
3.1 派琴虫病Perkins0sis 帕金虫病 由海洋派琴虫(P.marinws),奥尔森派琴虫(P.olkseni)等在宿主血细胞内寄生或者游离在结缔组 织、钯、内脏或套膜上皮中而引起的水生动物的一种严重的寄生虫病
注:除P.marinus、P.olseni之外,病原还包括P.gugwadi、P.chesaeaki、P.andretwsi和P.mediterraneus
3.2 ct值eyelethreshold 荧光PCR反应中,荧光信号到达设定的值所经历的循环数
材料 除另有规定外,所用化学试剂均为分析纯
试验用水要求达到GB/T6682中一级水的要求
4.1液体筑基乙酸盐培养基(luidthioglycolatemedia,F:TM);具体配制方法见附录A
4.2卢戈氏碘液(Lugol'siodine);配制方法见附录A
4 3 2.5%叙霉素:配制方法见附录A
4.41%制霉菌素;配制方法见附录A 4.5酚-三氯甲婉抽提法所需要的相关试剂或其他DNA抽提试剂盒,见附录A
4.610×PCRbuffer,25mmol/L.MgCl,dNTP(2.5mmol/L或10mmol/L)、5U/ALrTaqDNA聚 合酶等,均为商品化试剂盒中成分
4.7琼脂糖
4.8电泳缓冲液;配制方法见附录A
4.9引物及探针:包括PCR引物及荧光PCR引物和探针
GB/26618一2011 设备 低温培养箱;能够进行22C24C培养
5 1 5.2生物显微镜
5.3一20C普通冰箱、一70C的超低温冰箱、4C冰箱
5. 组织研磨器
4 5.5高速冷冻离心机
5.6PCR扩增仪
5.7茨光PCR扩增仪
5.8电泳仪
5.9凝胶成像仪或紫外透射仪 水浴锅
派琴虫的检测方法 6.1采样 6.1.1采样点的选择 按照GB/T18088规定方法进行
应根据实际情况，一个区域的一个种群至少选取3个采样点,大 范围的几块不连续地区或者养殖易感品种的区域,应增加采样点
6.1.2采样技术要求 6.1.2.1有临床症状的贝类 牡蛎感染派琴虫的症状表现为消化腺发白,贝壳不能闭合,套膜收缩,性腺发育受到抑制、偶尔也会 出现脓肿,身体严重衰弱,生长迟缓等
采样时,至少挑选10条濒死的或可疑的个体
采样时贝类应当 是活的,贝类应当在活体或杀死后分别包装放在冷藏的容器中送到实验室
所采集的贝类样品应避免 冰冻
主要采集贝类的蟋、套膜、消化腺、闭合肌等
6.1.2.2无临床症状的贝类 当养殖场的个体有怀卵时,应每年在产卵期采集一次精液或卵液
如怀卵群体由不同年龄的贝类 个体组成,应选取两岁龄的贝类采样
样品应包括该地所有的易感品种
每次采样的贝类数量要以感 染率等于或大于2%时检出的概率进行抽样
通常情况是至少采集150个贝类 对无临床症状的贝类,取其鳗,套膜,消化腺、闭合肌等
6.1.2.3监测目的的采样 监测时间应选在一年中最能观察到临床症状并能检测到该虫的季节
采样数量参见6.1.2.2 6.1.2.4样品保存及运送 采取的样品应在取样后24h内,冷藏送人实验室,要附有标签,清楚标明采样地点,来源和养殖历 史,实验室内冷藏保存备检
虫体培养 6.2.1样品的选择 选取垂死的新鲜贝类样品
6.2.2样品前处理 将贝壳弃掉,置于灭菌的研钵,剪刀剪至1mm3mm大小
样品的培养 将样品分别置于含5mLFTM培养基的灭菌试管中,加250L2.5%的氢霉素摇匀,用1mL1% 制霉菌素覆盖在液面,盖好盖子,22C24C低温培养箱中暗室培养4d~7d
GB/T26618一2011 6.2.4样品的纯化 将培养后的样品4000r/min离心10min,弃上清液,加6ml.2mol/LNaOH,涡旋混匀后置于 60C烘箱内消化过夜
4000r/min离心10min,弃上清液,加2ml.ddH.O洗涤,4000r/min离心 10min,弃上清液,重复上述步骤2次一4次
6.2.5染色镜检 将纯化的样品置于2mddH.O中摇匀,加人80L卢戈氏碘液染色后,取40AL于载玻片上,盖 上盖玻片后,在显微镜(10×10)下顺序观察
6.2.6结果判断 显微镜下,经过FTM培养后,派琴虫发育为休眠袍子,呈圆形，蓝黑色,直径大多在304nm~ 80Am
形态参见附录B
6.3CR检测 6.3.1材料 选取活的或刚死的贝类的钯组织,也可采用乙醇或者低温保存的贝类跚组织样品
6.3.2操作步骤 6.3.2.1DNA的提取 取25mg样品,剪碎后见附录A中提取组织DNA的方法提取基因组DNA,也可采用商品化的组 织基因组DNA提取试剂盒进行
除检测样品外,需要设立如下对照: -取已知感染派琴虫的贝类组织作为阳性对照 -取未患病的贝类组织作为阴性对照 空白对照
6.3.2.2引物 上游引物:5'-CcGCTTTGTTTGGMTccC3' 下游引物s'AcATcMccccTTCTAATGATG PCR预期扩增派琴虫属的ITs区域片段长度为666bp~672bp(具体序列参见附录C),引物合成 后均呆用灭菌ddH.0均稀释为10pmol/儿，一20亿保存备用 6.3.2.3反应体系 在PCR管内,加人10×PCRbuffer2.5l、5U/l
TaqDNA聚合酶0.5l,10Amol/L上下游 引物各0.5l,2.5mmol/LdNTP2L,模板DNA10l,补充ddH,O至25L
PCR操作时,取等体积的ddH.o代替DNA模板作为空白对照
6.3.2.4扩增程序 95C预变性4min;之后95C变性1min.53C退火1min,65C延伸3min,共40个循环;最后 65C补充延伸5 min
6.3.2.5琼脂糖电泳 取5PCR扩增产物,在1×电泳缓冲液内进行1%一2%的琼脂糖凝胶电泳,电泳结束后,用紫外 灯或凝胶成像仪观察是否扩增出预期大小的特异性DNA片段
6.3.3结果判定 6.3.3.1试验成立的条件 阳性对照有预期大小的扩增条带,阴性对照及空白对照没有相应片段的CR产物
否则试验 无效
6.3.3.2样品检测结果 在阳性对照,阴性对照,空白对照都成立的前提下,若检测样品有预期大小的条带,则PCR结果阳 性,若检测样品无预期大小的条带,则PCR结果阴性
GB/26618一2011 4 实时荧光PCR检测 6. 6.4.1实验材料与DNA提取 材料与DNA的提取以及阴、阳性对照及空白对照的设置同PCR操作部分
6.4.2操作步骤 6.4.2.1引物与探针设计 上游引物:5'-CAAACTCTCAACGATGGATGCC-3 下游引物5'-TGCAAATcGCAGTGCTTATcG3" TaqMan荧光探针:5'-FAM-ACTTcGCTGCGTCCTTCATcGATTCTCGECLIPSE-3 引物和探针合成后均采用灭菌ddH.O稀释为10mol/L
扩增片段长度为78bp(具体序列参见 附录C)
6.4.2.2反应体系 取10AL组织基因组DNA作为模板,加人按照表1配制的荧光PCR反应液中 表1荧光PCR反应液配制 剂 试 体积/l 2.5 0×PCR缓冲液(Mg”Free) 25mmol/1MgC 5.0 2.5mmoldNTP 上、下游引物及探针(均为10umol/L)等体积混合液 1.5 5U/l
TaqDNA聚合酶 0.5 灭菌ddH,o 3.5 6.4.2.3扩增程序 95预变性3min;然后按照如下程序进行反应95C变性15s.57C退火1min,45个循环,每个 循环结束后采集FAM通道数据
6.4.3结果判定 6.4.3.1试验成立判定 反应结束后,仪器将自动给出每个样品的C值
记录C值,分析检测结果
只有阳性对照有扩增曲线,而且C<35;同时阴性对照无扩增曲线或者扩增曲线C>一40的,才可 判定本次试验成立,否则本次试验无效
6.4.3.2阳性判定 如果样品的CR扩增曲线C/<35,则荧光PCR检测阳性
6.4.3.3阴性判定 如果样品无扩增曲线或者扩增曲线C>40,则荧光PCR检测阴性
6.4.3.4可疑判定 如果35
GB/T26618一2011 附 录A 规范性附录 样品DNA抽提及溶液配制 A.1样品DNA的抽提 A.1.1取新鲜贝类的消化腺上皮、腮、触须等组织25mg置于冰冷的生理盐水中反复冲洗，滤纸吸干 表面水分后称重,置于匀浆研磨器中并加人冷的生理盐水,进行手工匀浆研磨
注意整个过程在冰上 完成
A.1.2将匀浆液倒人1.5mL离心管中,加20l蛋白酶K(20mg/mL),再加SDS至终浓度为1%、 上下颠倒混匀
A.1.3混合液置于55C水浴锅内水浴2.5h
1.4向匀浆液中按1:1比例加人酚十三氯甲炕十异戊醉混合液(25十24+1),上下颠倒混匀 12000r/min离心5min. A.1.5转移上层水相,加人等体积三氯甲烧十异戊醇混合液，上下颠倒混匀,12000r/min离心 5min 1.6转移上层水相,加人两倍体积的无水乙醉醇,-20C放置30min至过夜
12000r/min离心5min,沉淀DNA,倾去上清液
1.8于沉淀中加人75%乙醇溶液500L,轻轻混匀后12000 n离心5min,倾去上清液,室温 r/n i 凉干
A.1.9用20LTE缓冲液溶解DNA沉淀，一20C保存备用
组织DNA提取也可采用等效的商品化DNA提取试剂盒,按照说明书进行操作
A.2电泳缓冲液的配制 50倍TAE电泳浓缩缓冲液配制方法为:取Tris碱242g,冰醋酸57.1ml,0.5mol/IEDTA 10mlL用5mol/几的HCI调制pH8.0,定容至1000mL
用前采用蒸憎水50倍稀释即可
A.3液体琉基乙酸盐培养基(FTM)的配制 称取筑基乙酸盐29.75g,放人1L蒸懈水,在微波炉中加热,直到变成金黄色透明液为止冷却后 分装于10mL的培养试管中,每管5mL高压灭菌,冷却后,用锡衔纸包裹,放人4C冰箱中保存备用
A.4卢戈氏碘液的配制 取厅区殃化娜(K1)游于20 nml.dHo中,搅拌到游解后,加人4只慎,等碘充分游解,再加人 80ml蒸憎水,贮存在棕色试剂瓶内待用 A.52.5%氯霉素的配制 2.5尽叙霉素游解于10mLdlHo中,贮存在试剂瓶内,放人4C冰箱中保存备用 A.6 1%制霉菌素的配制 1g制霉菌素溶解于100mL.ddH.O中,贮存在试剂瓶内,放人4C冰箱中保存备用
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派琴虫病诊断操作规程GB/T26618-2011
一、前言
派琴虫病是一种常见的传染病，对家禽养殖业造成了严重的危害。为了及时、准确地发现和控制这种疾病，需要有一套科学、规范的诊断操作规程。本文将介绍派琴虫病诊断操作规程GB/T26618-2011的相关内容。
二、样品采集
样品采集是派琴虫病诊断的第一步，必须保证取得的样品质量优良、数量充足。通常情况下，样品可以选择淤血物、粪便、鸡脑、心肝等组织。
采集样品时应注意以下几点：
- 尽量选择病死鸡，以增加检测的准确性；
- 避免样品污染或受到外界因素的影响；
- 根据不同的样品类型和检测方法选择不同的采集器具。
三、样品处理
样品处理是派琴虫病诊断的第二步，其目的是提取样品中的有用成分，并滤除干扰物质。常用的处理方法包括：
- 离心法：适用于液态样本的处理，根据样品的密度差异进行分离；
- 振荡法：适用于固态样本的处理，通过振动使细胞组织破碎并释放出目标成分；
- 均质法：适用于大体积样品的处理，利用高速旋转的机械刀片将样品剪切成细小颗粒。
四、样品检测
样品检测是派琴虫病诊断的最后一步，主要通过显微镜观察、免疫学方法、PCR技术等手段进行。
其中，显微镜检测是最常用的方法之一。在检测中，应注意以下几点：
- 样品处理后，应使用适当的染色剂染色；
- 观察时应选择适当的倍数和视野，避免过度或不足；
- 根据派琴虫的形态特征进行判别，同时注意排除其他寄生虫的可能性。
五、总结
派琴虫病是家禽养殖业中的重要疾病之一，对于诊断工作的开展具有重要意义。本文介绍了派琴虫病诊断操作规程GB/T26618-2011的相关内容，包括样品采集、处理、检测等方面的要点。希望本文能够对从事相关领域工作的专业人员有所帮助。
派琴虫病诊断操作规程的相关资料
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