牛奶和奶粉中恩诺沙星、达氟沙星、环丙沙星、沙拉沙星、奥比沙星、二氟沙星和麻保沙星残留量的测定液相色谱-串联质谱法

牛奶和奶粉中恩诺沙星、达氟沙星、环丙沙星、沙拉沙星、奥比沙星、二氟沙星和麻保沙星残留量的测定液相色谱-串联质谱法

国家标准 GB/T22985一2008 牛奶和奶粉中恩诺沙星、达氟沙星、 环丙沙星、沙拉沙星、奥比沙星、 二氟沙星和麻保沙星残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Determinationofenrofoxaein,danofloxaein,eiprofloxaein,sarafiloxacin orbifloxaein,difoxaeinandmarbofloxaeininmikandmilkpowder LC-MS-MSmethod 2008-12-31发布 2009-05-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T22985一2008 前 言 本标准的附录A,附录B为资料性附录 本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口 本标准起草单位;秦皇岛出人境检验检疫局、河北出人境检验检 疫局 本标准主要起草人:陈瑞春、吕红英、段文仲、郭春海、艾连峰、邢军、马育松、姚春毅、庞国芳
GB/T22985一2008 牛奶和奶粉中恩诺沙星、达氟沙星、 环丙沙星、沙拉沙星、奥比沙星、 二氟沙星和麻保沙星残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 范围 本标准规定了牛奶和奶粉中恩诺沙星、达氟沙星、环丙沙星、沙拉沙星、奥比沙星、二氟沙星和麻保 沙星残留量液相色谱-串联质谱测定方法 本标准适用于牛奶和奶粉中恩诺沙星,达氟沙星,环丙沙星、沙拉沙星,奥比沙星,二氟沙星和麻保 沙星残留量的测定和确证 本标准的方法检出限;牛奶中恩诺沙星,达氟沙星,环丙沙星、沙拉沙星、奥比沙星、二氟沙星和麻保 沙星均为14g/kg;奶粉中恩诺沙星、达氟沙星、环丙沙星、沙拉沙星、奥比沙星、二氟沙星和麻保沙星均 为44g/kg" 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度正确度与精密度第1部分:总则与定义 GB/T6379.1一2004,IsO5725-1:1994,IDT GB/T6379.2测量方法与结果的准确度(正确度与精密度第2部分;确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法(GB/T6379.2一2004,IsO5725-2;1994,IDT) GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682一2008,IsO3696:1987,MOD 原理 用乙睛和磷酸盐缓冲溶液提取试样中残留的恩诺沙星达氟沙星、环丙沙星、沙拉沙星、奥比沙星、 二氟沙星和麻保沙星,OasisHLB固相萃取柱'净化,5%氨水甲醇溶液洗脱,液相色谱-串联质谱测定， 外标法定量 试剂和材料 除另有说明外,所用试剂均为优级纯,水为GB/T6682规定的一级水 4.1甲醇;色谱纯 4.2乙睛色谱纯 4. 磷酸;色谱纯 3 4 甲酸:色谱纯 1 OasisHLB固相萃取柱是water公司产品的商品名称,给出这一信息是为了方便本标准的使用者,并不是表 示对该产品的认可 如果其他产品具有相同的效果,则可使用这些等效产品
GB/T22985一2008 4.5磷酸氢二钠,NaHPO12H.O. 4.6磷酸二氢钾,KHPO 4.7氨水 4.8磷酸盐缓冲溶液(o.05mol/L);称取5.68g磷酸氢二钠(4.5)和1.36g磷酸二氢钾(4.6),放人 1000mL烧杯中,加人800mL水溶解,用磷酸(4.3)调至pH=3.0,再用水定容至1000mL 4.95%氨水甲醉溶液;吸取50ml氨水(.7)与950ml甲醉(.1)混合 4.10甲酸溶液(pH=3.0);量取500ml.水,用甲酸(4.4)调pH值到3.0 4.1125%甲醇溶液;量取250nL甲醇(4.1)用水稀释到1000mL 4.12甲醇-甲酸溶液(15十85);量取30mL甲醇(4 )与170mL甲酸溶液(4.10)混合 1 4.13标准物质:恩诺沙星、达氟沙星,环丙沙星、沙拉沙星、奥比沙星、二氟沙星、麻保沙星标准物质,纯 度大于等于95% 4.14标准储备溶液;0.1mg/mL 准确称取适量的每种标准物质,用甲醇(4.1)配成0.1mg/mL的 标准储备溶液,该溶液在4C保存 4.15 混合标准中同游液lp唱/ml 分别吸取1ml标准储备蒂液(4.1)放人100nl容量瓶中,用 甲醇(4.1)定容至刻度 该溶液在4C保存 4.16混合标准工作溶液:根据需要用空白样品提取液配不同浓度的混合标准工作溶液,混合标准工 作溶液在4C保存 ,3 3ml 使用前分别用5ml甲醇和5mL.水和5mL确 4.17OasisHLB固相萃取柱或相当者:60mg 酸盐缓冲溶液(4.8)活化,保持柱体湿润 4.18滤膜:0.2m 仪器和设备 5.1液相色谱-串联四极杆质谱仪,配有电喷雾离子源 5.2分析天平;感量0.1mg和0.01g 5.3涡旋振荡器 5.4固相萃取装置 5. 很气吹干仪 .6 5 真空泵;最大负压80kPa 5.7pH计测量精度士0.02pH单位 5.飞 贮液器;通过转接头连接于OasisHLB固相萃取柱上 5.9离心机 55. .10旋转蒸发仪 5.11具刻度离心管:10ml 试样的制备与保存 6 试样的制备 将牛奶从冰箱中取出,放置至室温,摇匀,备用 6.2试样保存 牛奶置于！C冰箱中避光保存,奶粉常温避光保存 测定步骤 7.1提取 7.1.1牛奶 称取2g试样,精确到0.01g,置于50ml具塞塑料离心管中,加人10ml乙睛,于涡旋振荡器振
GB/T22985一2008 荡提取1min,5000r/min离心5min,上清液过滤到鸡心瓶中,在残渣中加人5m磷酸盐缓冲溶液 4.8),l0ml乙睛,重复以上步骤,合并上清液,于50C旋转蒸发,至乙睛全部蒸出 加人5ml磷酸 盐缓冲溶液.混匀 7.1.2奶粉 称取0.5g试样,精确到0.尽置于50mL具塞塑料离心管中,加人6ml磷酸盐缓冲溶液 (4.8),涡旋混匀,再加人10mL乙睛,于涡旋振荡器振荡提取1min,5000r/min离心5min,上清液过 滤到鸡心瓶中,在残渣中加人5mL磷酸盐缓冲溶液,10ml乙,重复以上步骤,合并上清液,于50 旋转蒸发,至乙晴全部蒸出 加人5mL磷酸盐缓冲溶液,混匀 7.2净化 将7.1的样液转移到贮液器中,再用5mL磷酸盐缓冲溶液洗鸡心瓶,洗液合并到贮液器,以约 1mL/min的流速全部过HLB固相萃取小柱(4.17),待样液完全流出后,先后以4mL水、4mlL25%甲 醇水溶液淋洗,抽干,用4mL5%氨水甲醇溶液(4.9)洗脱于10ml具刻度离心管中,洗脱液于50C 氮气吹至约0.2mL.时停止浓缩,用甲醉-甲酸溶液(4.12)定容至1ml,5000r r/min离心5min,过 0.2Am滤膜,供液相色谱串联质谱分析 空白基质溶液的制备 将取牛奶阴性样品2g,奶粉阴性样品0.5g,按7.1和7.2操作 测定条件 液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下 色谱柱.Cn了wm,l50mmx2.lmm(内径)或相当者 a) 色谱柱温度:30C b e)进样量;15l; d)流动相梯度及流速见表1 表1液相色谱梯度洗脱条件 0.1%乙酸水溶液/% 时间/min 流速/(L/min 甲醇/% 80 0.00 200 20 60 5.00 200 40 200 40 60 9.00 9.10 200 80 20 l1.00 200 80 20 7.4.2质谱参考条件 质谱参考条件如下 a)离子化模式;电喷雾正离子模式(EsI+): b) 质谱扫描方式:多反应监测MRM); e)鞘气压力:104kPa; d 辅助气压力;138kPa; 正离子模式电喷雾电压(Is):40o0v 毛细管温度;320C; 源内诱导解离电压:l0V; hh Q1,Q3分辨率:Q1为0.4,Q3为0.7， 碰撞气:高纯氧气 碰撞气压力:0.2Pa;
GB/T22985一2008 k其他质谱参数及7种唾诺酮的CAS号、保留时间见表2 表2七种隆诺酮类药物保留时间、CAs号,定性离子对定量离子对和裂解能量 保留时间" 定性离子对 定量离子对 裂解能量/ CAs号 化合物中文名称化合物英文名称 eV min n/ / 360,10/315,97 19 恩诺沙星 enrofloxaein 5.66 93106-60-6 360.14/316.08 360.10/244.86 24 22 358.14/339.83 达氟沙星 danofloxacin 6.18 119478-55-6 358.l4/340.00 358,14/313.80 32 332.30/288.14 15 环丙沙星 93107-08-5 eiprofloxaein 6.51 332.30/288.14 332.30/244.88 23 386.11/341.77 19 沙拉沙星 sarafloxacin 6.17 98105-99-8 386.10/341.7？ 386,l1/298,83 25 396.05/352.01 20 奥比沙星 orbifloxaein 6.71 113617-63-3 396.05/352.01 396.05/394.98 25 400,12/355,71 18 二氟沙星 difloxaein 7.06 124858-35-1 400.12/355.71 400,12/298,85 30 17 363.15/319,91 115550-35-1 363.15/319.91 7.05 麻保沙星 marbofloxacin 363.15/344.95 20 7 .4.3液相色谱-串联质谱测定 7.4.3.1 定性测定 每种被测组分选择1个母离子,2个以上子离子,在相同实验条件下,样品中待测物质的保留时间， 与混合基质标准校准溶液中对应的保留时间偏差在土2.5%之内;且样品谱图中各组分定性离子的相对 丰度与浓度接近的混合基质标准校准溶液谱图中对应的定性离子的相对丰度进行比较,偏差不超过 表3规定的范围,则可判定为样品中存在对应的待测物 表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度K -50 20GB/T22985一2008 结果计算 试样中每种唾诺酮残留量按式(1)计算 ×I0 5x X，= 000 式中: -试样中被测组分残留量,单位为微克每千克(4e/ke) 从标准工作曲线上得到的被测组分溶液浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL.): V 样品溶液定容体积,单位为毫升(mL); -样品溶液所代表试样的质量,单位为克(g) 77m i表示第i种呤诺酮,计算结果应扣除空白值 精密度 9.1一般规定 本标准的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的,重复性和再现性的值 以95%的可信度来计算 9.2重复性 在重复性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限(r),牛奶和奶粉中七种唾 诺酮的舔加浓度范围及重复性方程见表4,表5 表4牛奶中七种唾诺酮的添加浓度范围及重复性和再现性方程单位为微克每千克 再现性限R 化合物名称 添加浓度范围 重复性限" 恩诺沙星 1.010.0 r=0.1313m一0.0985 R=0.2018m-0.1500 达氟沙星 1.0l0.0 r=0.0942m一0.0351 lgR=1.1637lgm-0,9122 R 环丙沙星 1.010,0 r=0.0737m+0.0168 =0.122l十0.1099 r=0.0783m-0.0281 R=0.1240m0.0584 沙拉沙星 1.0~10.0 -0.0690m一0.0087 -0.8377 奥比沙星 1.0l0.0 gR=1.0398lgm R r=0.0905m一0.0343 =0.1710m一0.0612 二氟沙星 1.0一l0.0 1.0~l0.0 =1.0992lgm-1.0940 R=1.0162lg川一0.804 6 麻保沙星 lgr一 lg1 表5奶粉中七种唾诺酮的添加浓度范围及重复性和再现性方程 单位为微克每千克 添加浓度范围 重复性限，" 再现性限 R 化合物名称 恩诺沙屋 4.0一40.0 lgr=0.9319lgm一0.9356 lgR=1.0695lgm一0.9456 R=0.1782m-0.0346 达氟沙星 =1.0358gm-1.0438 4.040.0 lgr= 环丙沙星 4.040.0 lgr=0.7928lgm一0.8237 lgR=0.9275lgm一0.7228 沙拉沙星 4.040.0 =0.0746m十0.1785 lgR=0,8883lgm一0,6491 R 奥比沙星 4.040.0 r=0.0712m+0.061o =0.1l09m十0.2602 4.040.0 lgr=0.9401lgm-0.9084 gR=0.9051lgm一0,6383 二氟沙星 麻保沙星 4.040.0 lgr=0.9285lgm-0.8998 gR=0.8448lgm一0.5742 如果差值超过重复性限,应含弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定 再现性 在再现性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限(R)牛奶和奶粉中七种呤 诺酮的添加浓度范围及再现性方程见表4,表5 s
GB/T22985一2008 附 录A 资料性附录 标准物质多反应监测(MRN)色谱图 七种唾诺酮标准物质多反应监测(MRM)色谱图.见图A.1 Rr:4.00-9.00 RT:4.00-9.00 RT:5.66 RT:6.71 100%% 100% 恩诺沙星 类比沙星 50% 360.10/315,97 50% 396.05/352.01 RT:5.65 RT:6.71 100% 100% 奥比沙星 恩诺沙尿 0% 50% 396.05/394.98 360.10/244.86 .巴A.M RT7.06 RT:6,18 100% 100% 达氟沙星 二氟沙星 50% 50% 358.14/339.83 400.12/355.71 RT:6.62 RT;7.67 RT7.06 RT:6.18 100% 00% 二沙星 50% 50% 达氟沙展 400.12/298.85 358.14/313.80 RT:7.05 RT;6.51 100% 100% 麻保沙星 50% 50% 环丙沙星 363.15/319.91 332.30/288.14 RT:7.05 RT:6.51 100% 1009% 环丙沙星 麻保沙星 509% 0% 332.30/244.88 363.15/344.95 RT:7.41 RT:6.17 RT:6.17 100% 100% 沙拉沙屋 沙拉沙星 0% 509% 386.11/341.77 386.11/298.83 /min /min 注图中前面的为定量色谱图,后面的为定性色谱图 图A.1七种唾诺酮标准物质多反应监测(NMIRM)色谱图
GB/T22985一2008 附 录 B 资料性附录 回 收 率 七种唾诺酮添加浓度及其回收率范围的试验数据,见表B.1 表B.1七种隆诺酮添加浓度及其回收率范围的试验数据 牛奶 奶粉 化合物名称 添加浓度/(4g/kg 回收率范围/% 添加浓度/4g/kg 回收率范围/% 80,8108,0 76,0101.2 86.6100.6 86.9101.5 麻保沙星 77.395.0 78.8~96.0 20 1o 81.2~92.0 40 83.8~93.4 76,8~90.1 89.0~l00.3 92.6 75.2~95.3 环丙沙星 73.8l00.2 20 76.098.6 10 79.192.3 40 82.5一94.6 70.4 87.4一l09.4 一1o1.3 84.097.6 81.6~90.7 达氟沙星 77.0~102.1 74.6~93.9 20 10 78,592.1 40 81.8~94.0 85,9~102.0 75.293.8 76.l91.l 77.l~100.1 恩诺沙星 80.8~101.1 20 78,6l01.5 l0 40 79,4一92.2 81.8~92.7 83.9~1l05.0 80,9~lo1.7 81.5一96.0 82.4~100.5 奥比沙星 77.2~98." 20 77.2~100.2 79.793.6 40 79.290.4 72.197.1 78,6100,9 78,295.5 81.194.8 沙拉沙星 7.1 84.6103.7 20 97.8 10 84.593.8 40 80.594.0 88,9~108.1 82.3~96.0 88.199.3 84.196.1 二氟沙星 20 85.9~101.3 81.3108.0 84.494.6 40 80.992.2