GB/T38132-2019
转基因植物品系定量检测数字PCR法
QuantitativedeterminationofgeneticallymodifiedplantsbydigitalPCRmethod
- 中国标准分类号（CCS）A40
- 国际标准分类号（ICS）07.080
- 实施日期2019-10-18
- 文件格式PDF
- 文本页数9页
- 文件大小528.66KB
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转基因植物品系定量检测数字PCR法
国家标准 GB/T38132一2019 转基因植物品系定量检测数字PCR法 QuantitativedeterminationofgenetieallymodifiedplantsbydigitalPCR eth0d 2019-10-18发布 2019-10-18实施 国家市场监督管理总局 发布 币国国家标准化管理委员会国家标准
GB/38132一2019 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC387)提出并归口
本标准起草单位:上海市计量测试技术研究院、苏州百源基因技术有限公司、检验检疫科学研 究院、农业科学院生物技术研究所、测试技术研究院生物研究所、甘肃国研检验检测有限公司、 四川出人境检验检疫局检验检疫技术中心、科学院上海高等研究院
本标准主要起草人:梁文、付伟、李亮、刘刚、李妍、车团结、周李华、林华、杨镇州、朱鹏宇、马丽侠、 樊春海、王丽华、张莹
GB/38132一2019 转基因植物品系定量检测数字PCR法 范围 本标准规定了转基因植物品系的数字PCR定量检测方法
本标准适用于种子及物理加工种子样品中转基因玉米MON810品系、MON89034品系、MIR162 品系,转基因大豆GTS-40-3-2品系,转基因水稻克躯稻品系,转基因棉花GHB119品系,转基因油菜 RT73品系的数字PCR法定量检测
本方法的定量检测限为0.1%(质量分数). 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
凡是迷日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件
凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19495.1转基因产品检测通用要求和定义 转基因产品检测核酸提取纯化方法 GB/T19495.3 GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法 SN/T4853(所有部分转基因大米定量检测数字PCR法 术语和定义、缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件
3.1.1 speifese 品系特异序列 events eguence 外源DNA片段插人受体作物基因组后重组产生的邻接区序列
3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件
Adh-l:玉米乙醉醇脱氢酶基因(Aleoholdehydrogenase1 Adhe:乙醇脱氢酶c基因(Alcoholdehydrog renaseCgene PCR;聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction) PEP;磷酸烯醇式丙酮酸梭化酶基因(Phosphoenolpyruvatecarboxylasegene' PLD;磷脂酰胆碱磷脂水解酶基因(PhospholipaseDgene 原理 数字PCR其技术原理是通过将原始PCR反应体系进行分割,进而对所有小的反应体系进行扩增 并后续检测
通过对反应体系进行有限的分割,从而使整个反应体系可以更加耐受核酸抑制因子,并且 更加稳定、准确、快速地对痕量的转基因成分进行精准鉴定
GB/T38132一2019 目前数字PCR包括芯片式数字PCR和微滴式数字PCR两种
芯片式数字PCR通过微流控芯片 实现对原始反应体系的分割,这种分割方式具有稳定性好、均一性好的优点但试验成本相对较高;微滴 式数字PCR通过产生微小油包水体系实现反应体系的分割,这种分割方式反应速度快,分割成本更低
为了实现转基因植物品系数字CR定量检测,本标准通过数字PCR扩增反应直接得出转基因植 物外源基因品系特异序列)和植物内源基因的拷贝数含量
样品DNNA中的外源基因和内源基因的拷 贝数的比值(百分数)即为样品中相应的转基因植物品系的相对百分含量
试剂和材料 S 除另有说明,本方法使用的试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水
5.1植物基因组DNA提取试剂盒;推荐针对不同的样品选取不同的基因组提取试剂盒
数字PCR预混液;含有镁离子.,aNTP和具有5'3'外切活性的热启动TaqDNA聚合酶的数字 5.2 PCR专用预混试剂,推荐按照不同的数字PCR仪说明书选择
5.3引物及探针;检测不同植物品系的引物探针序列具体信息见表1
扩增序列的信息参见附录A
表1转基因植物外源基因及内源基因的引物和探针序列 靶标 类别 名称 序列 上游引物 GATGCCTTCTCCCTAGTGTTGA 玉米MON810品系 下游引物 外源 GGATGCACTCGTTGATGTTTG 特异序列 探针 FAMAGATACCAAGCGGCCATG;GACAACAA-BHQ1 上游引物 TTcTIccATATTGAccATCATACTcATT 玉米MON89034 cGGTATcTATAATAccG;TGGTTTTTAAA 外源 下游引物 品系特异序列 FAM-ATcCccGGAAATTATGTT-MGB 探针 上游引物 CAccTTcAGCAAcccGAACTA 玉米MIR162品系 外源 下游引物 GCTAGCCTCCACGATCATCTT 特异序列 探针 FAM-GTCCTCGTCGCTGCCCTTCACCT-BHQ 上游引物 CGTCGTTTCCCATCTCTTCCTCC 玉米基因Adh-1 内源 下游引物 ccAcrccGAGAcccTcAGTc VAATCAcccCTCATTTTCTCTCTCAHQ 探针 TAGCATcTACATATAGCTTc 上游引物 大豆GTs40-3:2 外源 GACCAGGCCATTCGcCTCA 下游引物 品系特异序列 探针 FAM-ACAAAACTATTTGGGATCGGAGAAGA-BHQ1 上游引物 GCCCTCTACTCCACCCCCA 下游引物 大豆基因lectin1 内源 GCCCATCTGCAAGCCT'TTTT Vc-AGcTrcGccGcTTccTTcAAcTTcAc-BHQ1 探针 上游引物 TccccAATGTGTATTAAGTTGTcTA 水稻克蜓稻品系 CcGATATGCCTGcCCATcT 外源 下游引物 特异序列 探针 FAM-CGTCAATTTGTTTACACCACAATATATCCCGBHQ1
GB/38132一2019 表1(续 靶标 类别 名称 序列 上游引物 TGGTGAGCGYTTTTGCAGTCT 水稻基因 下游引物 CTGATccACTAGCAGGAGG C 内源 PLD VIc-TGTTG;TGcTcCAATGTGGcCTG;BHQ1 探针 上游引物 ccAGTAcTAAAATccAGATcATGcAN 棉花GHB19品系 外源 下游引物 GAAATTGCGTGACTCAAATTCc 特异序列 探针 FAM-CCTGCAGGTCGACGGCCGAGTACBHQ1 上游引物 CACATGACTTAGCCCATCTTTGC 棉花基因 内源 下游引物 CcCCACCCTTTTTTGGTTTAGC Adhe 探针 FAMTGCAG;GTTTTGGTGC C A CTGTGAATGBHQ1 上游引物 ccATATTGAccATcATACTcATTGcT 油菜RT73品系 GCTTATACGAAGGCAAGAAAAGGA 下游引物 外源 特异序列 探针 FAM-TTCcCGGACATGAAGATCATCCTcCTT-BHQ1 上游引物 CCCTTGTGAAGCTCGACATC 油菜基因 内源 CTTGTcCTCTGACCATTCTTTGT 下游引物 PEP 探针 FAM-CCGACCGTCACACCGATGTTTTAGA-BHQ1 仪器与设备 6.1数字P(CR仪
6.2分析天平;:感量0.1mg 6.3生物安全柜
6.4核酸定量仪
6.5涡旋振荡仪
6.6移液枪:量程0.lL2.5L;量程0.5!L10L;量程10pL100!L;量程100L1000pL
操作步骤 7.1抽样 按照GB/T19495.1和GB/T19495.7的规定执行
7.2制样 按照GB/T19495.1和GB/T19495.7的规定执行
7.3DNA模板制备 按照GB/T19495.1和GB/T19495.3的规定执行
GB/T38132一2019 7.4DA模板浓度控制 采用PicoGreendsDNA荧光定量试剂盒或其他具有等效结果的核酸定量仪或方法测定DNA溶液 的浓度,具体操作步骤参照相关仪器或试剂盒说明书
然后根据植物基因组的相对分子质量大小计算 DNA的拷贝数浓度
浓度要求符合SN/T4853的规定
7.5数字CR扩增方法 7.5.1数字PCR反应体系 转基因玉米MONN810品系、MON89034品系、.MIR162品系,转基因大豆GTS-40-3-2品系,转基因 水稻克螟稻品系采用双重数字PCR反应体系见表2
转基因棉花GHB119品系,转基因油菜RT73品 系采用单重数字PCR反应体系见表3
数字PCR反应体系的总体积可根据不同厂家、型号的数字 PCR仪做相应调整,并保持各引物探针组分终浓度不变
每个DNA模板应进行3个平行数字PCR扩护 增反应
表2双重数字CR反应体系 PCR反应试剂 终浓度 体积 内源基因上游引物(10mol/L 0.54mol/I 1AL 内源基因下游引物(10mol/L) 0.5Hmol/I 1Al 内源基因探针(molL 0.1mol/1 0,4Al 0.5mol/L 外源基因上游引物10nmol/L》 1A儿 外源基因下游引物(104mol/L) 0.5丝nmol/L 1L. 外源基因探针(5mol/1 0.1mmol/1 0.4Al 2×数字PCR预混液 10L DNA模板 2Al ddH.o(无菌水) 3,2Al 表3单重数字CR反应体系 PCR反应试剂 体积 终浓度 2×数字CR预混液 10L 外源/内源基因上游引物(10Amol/I 0,.9Amol/L 1.8l 外源/内源基因下游引物(10mol/L 0.9Hmol/I 1.8l 探针(10Mmol/L 0.25Hmol/L 0.5nl DNA模板 2Al ddH.o(无菌水 3.9AL 7.5.2数字PCR反应程序 数字PCR反应程序如表4和表5所示
GB/38132一2019 表4微滴数字CR的反应程序 步骤 时间和温度 循环数 热激活及变性 10min/95 " 退火延伸 1min/56"C 39 变性 30s/94C 10min/98 酶失活 表5芯片数字CR反应程序 步骤 时间和温度 循环数 热激活及变性 10min/96 退火延伸 2min/60 39 变性 30s/98C c 退火延伸 2min/60 注不同芯片平台可根据说明书对除退火延伸外步骤中的温度和时间做相应调整
7.5.3对照数字PCR反应的设定 试验中应设置阳性对照、阴性对照和空白对照
用含品系特异序列的转基因植物品系基因组DNA 做阳性对照,含相同内源基因的非转基因植物基因组DNA做阴性对照,以水作为空白对照
各对照 PCR反应体系中,除模板外,其余组分及PCR反应条件与7.5.1和7.5.2相同
结果分析与表述 8.1质量控制 根据数字PCR结果中阴性对照的终点荧光值设定阂值限,该值限应将同一样品中阴性反应微小 单元和阳性反应微小单元有效区分
阴性对照有内源基因扩增且阴性对照和空白对照均无外源基因扩增 扩增平行重复测试结果(转基因品系百分含量)的相对标准偏差应小于或等于25%
以上要求其中一条不符合,应重新进行试验,重新进行的试验应从制备测试样品开始
8.2结果分析 按照式(1)计算测试样品的转基因品系百分含量 ×100% B 式中: 转基因植物品系的百分含量; 转基因植物品系外枞基园烤贝数" A B 转基因植物内源基因拷贝数
GB/T38132一2019 8.3结果表述 8.3.1检出物种内源基因,但未检出品系特异序列,结果表述为“样品未检出×品系转基因成分
定量 方法的检测限为0.1%” 8.3.2检出物种内源基因,同时也检出品系特异序列,结果表述为“样品中×品系转基因成分的含量 为×%"
GB/38132一2019 录 附 A 资料性附录 转基因植物品系特异性扩增序列 A.1转基因玉米NON810品系特异性序列 GATGCCTTCTCCCTAGTGTTGACCAGTGTTACTCACATAGTCTTTGCTCATTTCATTGT AATGCAGATGCCAAGCGGCCATGGACAACAACCCAAACATCAACGAGTGCATCC 转基因玉米MON89034品系特异性序列 TTCTCCATATTGACCATCATACTCATGCATCCCCGGTTATATATGTTTTTTTAAACCA CGGTATTATAGATACCG A.3转基因玉米MIR162品系特异性序列 CACCTTCAGCAACCCGAACTACGCCAAGGTGAAGGGCAGCGACGAGGACGCCAAGATG ATCGTGGAGGCTAAGC A.4转基因大豆GIs-40-3-2品系特异性序列 AGCATCTACATATAGCTTCTcGTTGTTAGAAAAACAAAACTATTTGGGATCGGAGAA GAACTGTTTGAGGCGAATGGCCTGGTC A.5转基因水稻克蜈稻品系特异性序列 TCCGCAATGTGTTATTAAGTTGTCTAAGCGTCAATTTGTTTACCCACAATATATcccG AGATGGGCAGGCATATCGG A.6转基因棉花GHB119品系特异性序列 CCAGTAcTAAAATcCAGATCATGCATGGACCTGCAGGTcGAcGGCcGAGTACTGrTTT ATTTTTAACAGGAATTTGAGTCAcGCAATTTC 转基因油菜RI73品系特异性序列 CCATATTGACCATCATACTCAT'TGCTGATCCATGTAGAT'T'TCCCGGACATGAAGATCA TCcTccTTccTTrccTTGccTTTccTTCcTTTrCcTTGCcTTcGTATAAGc 注:阴影部分为转基因品系外源基因序列,带下划线部分为植物基因组内源基因序列
转基因植物品系定量检测数字PCR法GB/T38132-2019的原理与应用
随着人类对食品安全的要求越来越高，转基因食品的检测变得尤为重要。而转基因植物是获得转基因食品的主要来源，所以对转基因植物进行检测显得十分关键。GB/T38132-2019标准中提出了一种定量检测转基因植物品系的数字PCR方法，下面将详细介绍其原理和应用。
一、数字PCR原理
数字PCR（Digital PCR，dPCR）是一种通过将DNA分子分配到许多小反应器中进行计数的PCR技术。它可以极大地降低PCR反应的误差率，同时也能够提高PCR反应的灵敏度和特异性。
数字PCR的基本步骤包括：
- 将DNA样品加入到数字PCR反应体系中；
- 将反应物分配到许多小体积反应器中；
- 进行PCR扩增；
- 根据正反应和负反应计数分析。
二、GB/T38132-2019标准中的数字PCR定量检测方法
GB/T38132-2019标准中规定了一种用于转基因植物品系定量检测的数字PCR方法。该方法的具体步骤如下：
- 提取样品DNA；
- 设计合适的引物和探针，选择目标基因和内参基因；
- 进行数字PCR扩增，分配到许多小体积反应器中；
- 根据所选目标基因和内参基因在正反应和负反应中的计数情况，计算样品中目标基因的拷贝数；
- 通过比较样品的目标基因拷贝数和标准曲线上的标准点来定量检测目标基因。
三、数字PCR在转基因植物品系定量检测中的应用
数字PCR技术在转基因植物品系定量检测中有着广泛的应用。相比于传统的PCR技术，数字PCR可以更加准确地定量检测样品中的目标基因拷贝数。此外，数字PCR还可以在不需要特定引物和探针的情况下进行多重定量检测。
GB/T38132-2019标准中的数字PCR方法具有操作简便、结果可靠、适用范围广等优点，在转基因植物品系定量检测中得到了广泛的应用。
四、总结
转基因食品对人类健康和食品安全具有重要意义，而数字PCR技术的发展为转基因植物品系定量检测提供了新的思路和方法。GB/T38132-2019标准中提出的数字PCR定量检测方法具有着广泛的应用前景，可以帮助人们更加准确地检测转基因植物品系，保障食品安全。未来数字PCR技术还将不断发展，为转基因植物品系定量检测提供更加精准和高效的方法。
