榆韧皮部坏死植原体检疫鉴定方法

榆韧皮部坏死植原体检疫鉴定方法

国家标准 GB/T40141一2021 榆韧皮部坏死植原体检疫鉴定方法 DeteetionanlidentifieationofCandidat4sPhytoplasma ulmi 2021-05-21发布 2021-12-01实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标涯花管理委员会国家标准
GB/40141一2021 前 言 本文件按照GB/T1.1一2020<标准化工作导则第1部分;标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 本文件的发布机构不承担识别专利的责任 本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口 本文件起草单位;检验检疫科学研究院、内蒙古农业大学、青岛海关技术中心、上海市农业技术 推广服务中心 本文件主要起草人;赵文军,田茜、李正男、张红梅、牵海清、张京宜、罗金燕
GB/40141一2021 榆韧皮部坏死植原体检疫鉴定方法 范围 本文件描述了榆韧皮部坏死植原体的检疫和鉴定方法 本文件适用于进出境榆树苗木及接穗中榆韧皮部坏死植原体的检疫和鉴定 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 聚合酶链式反应polymerasechainreactiom;CR 以耐热DNA聚合膊相一对引物(与待渊目标核散分子序列同源的DNA片段》通过高温(DNA分 子变性)和低温(引物和目标核酸分子复性并被耐热DNA聚合酶延伸)交替循环扩增待测目标核酸分 子的方法 3.2 植原体phytoplasma 类无细胞壁,尚不能人工培养,主要分布于植物韧皮部筛管细胞、刺吸式介体昆虫的肠道、淋巴 唾液腺等组织 榆韧皮部坏死植原体基本信息 学名;CandidatusPhytoplasmaulmi 传播途径:依靠带病苗木进行远距离传播 榆韧皮部坏死植原体的其他信息见附录A 方法原理 S 该病害主要危害榆树,依靠带病苗木进行远距离传播 其生物学特性和16S基因序列等分子生物 学信息是该检疫鉴定方法的依据 16SrDNA相对保守,通过植原体通用引物R16F2/R16R2即可扩增 获得植原体16SrDNA序列 仪器设备和主要试剂 6.1仪器设备 PCR仪、,超净工作台,灭菌锅、高速冷冻离心机、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡
GB/T40141一202 器、移液器、电泳仪、凝胶成像分析仪 6.2主要试剂 RCR缓冲液.dNTPs、TuDNA聚合酶.PCR凝胶电泳检测试剂应符合附录B. 除另有规定外,所有试剂均为分析纯 检测与鉴定方法 7.1症状观察 仔细观察种苗是否表现植原体侵染症状,症状描述的信息见A.7 7.2DNA提取 称取100mg含有韧皮部组织的植物材料,剪成小块放人研钵中,加人液氮,待样品冷冻完全后快 速、用力研磨至粉状,随后直接用商业化植物基因组DNA提取试剂盒按照操作说明提取样品总DNA， -20C保存备用 7.3通用引物进行CR扩增并测序 利用植原体通用巢式引物R16mF1/R16mR1/R16F2/R16R2进行PCR扩增并测序,具体步骤应符 合附录B 7.4虚拟RFLP指纹图谱检测 利用iPhyclassifier在线分析软件或DNA-FPCluster软件对7.3测得的植原体16SrDNA序列进 行虚拟RFLP指纹图谱检测,具体步骤应符合附录C 8 结果判定 表现症状与附录A描述一致可初步判定怀疑感染榆韧皮部坏死植原体,但需通过7.3、7.4进一步 检测 在7.3检测中,若PCR产物凝胶电泳出现1200bp左右条带,可初步判定感染榆韧皮部坏死植原 体,经克隆测序及分析比对后,若与B.6中序列相似性大于97.5%,则可判定该样品携带榆韧皮部坏死 植原体 在7.4检测中,将测得的植原体16SrDNA序列经17种限制性内切酶RFILP指纹图分析,若RFLP 图谱与图C.1一致,则可判定该样品携带榆韧皮部坏死植原体 样品及检测结果保存 9.1样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存 对检出愉韧皮部坏死植原体的样品应保存于一70C冰箱 中,以备复核 该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理 9.2结果记录与资料保存 完整的实验记录包括;样品的来源、种类,送检时间,实验时间,地点、方法和结果等,并要有实验人 员和审核人员签字 PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片,需保存DNA序列和RFLP图谱
GB/40141一2021 附 录 A 资料性) 榆韧皮部坏死植原体其他信息 A.1名称与分类地位 中文名:榆韧皮部坏死植原体 学名:CandidatusPhytoplasmaulmi 异名;Emyellows-associatedphytoplasmas linoiselmyellowsphytoplasmas Elmphloemneerosisphytoplasma 英文名:Elmphloemnecrosisphytoplasma 分类地位;细菌界(Bacteria),厚壁菌门(Firmieutes),柔膜菌纲(Mollieutes),非固醉菌原体目 Acholeplasmatales)，非固醇菌原体科Acholeplasmataceae)，植原体候选属Candidatus Phytoplasma),16SrV植原体组 A.2寄主植物 该病害只能为害榆属的种类,主要包括美国本地的美国榆(Umusamericana),红愉(U,rubra) U.alata,U.serotina和U.crassifolia,嫁接试验表明该病害还能为害欧亚地区的U.minor,U.laevi、和 榔榆(U.arufolia). A.3地理分布 主要分布于北美洲地区北纬32"到46",西经71“到97"之间 欧洲:捷克、法国、德国、意大利(广泛分布). 北美洲;加拿大(安大略湖),美国亚拉巴马州,阿肯色州、佐洽亚州、伊利诺伊州、印第安纳州、艾奥 瓦州、堪萨斯州、肯塔基州,马里兰州、马萨诸塞州密歇根州、明尼苏达州、密西西比州、密苏里州、内布 拉斯加州、新泽西州、纽约、北达科他州俄亥俄州、俄克拉何马州、宾夕法尼亚州、田纳西州、弗吉尼 亚州 A.4传播介体 叶蝉(oMiarusatkinsoni)、苑丝子(C4scuta)等 A.5形态学特性 1000 植原体寄生于植物韧皮部的筛管内,形态大小约500nm1 nm,并能够通过细菌滤器,不具有 细胞壁,呈现多型性，一般有球形、椭圆形、长杆形、梭形、带状和多态不规则形等多型性 由于生长周期 不同,植原体呈现初生体、小球体、大球状体和丝状体等形态 A.6为害情况 受愉树韧皮部坏死植原体为害的植物根部组织大量增生肥大,组织纤维化并出现大量的根部坏死 这是植株感病后出现的最初症状,但是这种症状在地上部分出现明显的症状之前是很难观测到的 韧
GB/T40141一202 皮部坏死的外部症状是有很大差异的 在美国北部,病害引起的第一次落叶一般发生在7月中旬至 9月中旬,落叶中有发黄的叶片,有顶部的和未成熟的叶片 一般来讲,感病植株所有枝条都会立即显 症 有时候症状只会在植株某几个枝条上出现并扩散,而其他的枝条保持正常 但更多时候,枝条上的 所有叶片都变成淡黄绿色到黄色 在生长季节的晚期,感病植株上的叶片呈现出一种比预期时间早的外观 这种黄化以及外观比起 那些由于生长在岩石地区缺少肥料所引起的症状是完全不同的 显出生长晚期症状的感病植株有可能 在下个生长季节不能够正常抽芽或者生长,最后导致死亡 A.7症状特征 在早春,感病植株显示出的外部症状主要是不能够正常产生叶片,或者产生一些最后萎蔫变黄甚至 脱落的小叶 春末的时候,那些正常生长出叶片的植株一般会迅速萎蔫死亡,褐色干枯的叶片有可能在 这些已死的叶片上附着几个星期 盛夏季节植株通常会枯萎,但是这种情况一年四季都有可能发生 总体上讲，一般病株枯死于侵染后的第二年 落叶前,病株的树干和根部韧皮部会形成黄褐色斑块 在一些巨大的树干上会形成一些垂直融合 的巨大斑块 病株的形成层和木质部的表面也可能形成一些变色斑块,但是这些斑块一般不大于 如果在茎干表皮能够明显看到大块的黑色斑块,说明植株同时被感染荷兰愉树病和榆树韧皮部 mm 坏死病 暴露出来的病株韧皮部比健康植株更容易氧化褐变 红榆(U.rubra),美国榆(U.americana)、榔榆(U.baruifolia)感病症状见图A.1一图A.5 吧想 图A.1感病红榆(U.rubra)叶片变黄症状
GB/40141?2021 ?A.2в(U.americana)??? DeplantPathooa/Coneniv.Ihacg ?:??,?? ?A.3в(U.americana)?????
GB/T40141?202 antPahoowConelUnv.hacaNewYo0 Depl" ?A.4в(U.parifolia)??? PlanPathologConeluniv.Ihac0.NewYo ?A.5в(U.amerieana)???
GB/40141一2021 录 附 B 规范性) PCR扩增与测序分析 巢式引物序列 B.1 植原体通用引物 R16mF1;5'-CATGCAAGTcGAAcGGA-3" R16mR1;5'-CTTAAccCCAATCATcGA-3' R16F2:5'-ACGACTGcTGCTAAGACTGG-3' R16R2:5'-TGACGGGCGGTGTGTACAAAcccCG-3'" B.2PCR反应体系 2×PCRmix混合液12.5L,DNA模板2AL,双蒸水11.5L 取第一轮扩增产物1AL,稀释10倍,取稀释产物2L.为模板,进行第二轮扩增,反应体系同上 B.3阴性对照、阳性对照和空白对照的设置 阴性对照:以健康的榆树叶片DNA为模板 阳性对照:采用感病愉树叶片DNA为模板 空白对照:双蒸水 B.4PCR的反应参数 第一对引物R16mF1/Rl6mR1:94C预变性10min;94C变性30s,52C退火45s,72C延伸 1,35个循环后于72C保温10min lmin 第二对引物R16F2/R16R2:94C预变性10min;94C变性30s,52C退火45s,72C延伸1n min， 35个循环后于72笔保温10min,4C冰箱中保存 注:不同仪器可根据仪器要求对反应参数做适当调整 B.5琼脂糖凝胶电泳 制备2%的琼脂糖凝胶,以DNAMarker作为分子量标记,进行电泳分析,电泳结束后在凝胶成像 仪观察并记录结果 B.6序列测定分析 当琼脂糖凝胶电泳显示在1200bp左右有条带,对该条带进行克隆测序,并与GenBank中的登录 sequenee长度1248bp)进 号为叮436792.1(CandidadtiePHhrytoplasmaulmi16snlboonmalRNAgenre,partial 行序列比对
GB/T40141一2021 附 录 C 规范性) 虚拟RFLP指纹图谱分析 利用iPlhyclassifer在线分析软件或DNA-FPCluster软件将测得的植原体16srDNA序列 R16F2/RI6R2)进行虚拟酶切,选用17种限制性内切酶(AuIBamHIBfaIBrUI、DruI,EoRI HaeI、HhaI、HinfI,HpaI、Hal、KpnI,MboI,MseI,RsaI,Ss力I、TaqI) 酶切 后RFLP图谱如图C.1 此外,使用iPhyclassifier的组(亚组)划分功能(16Srgrop/subgroupclassif cationbasedonsinmilaritycoefeent),可以对未知植原体进行组与亚组的分类 DNA分子量标准选用Invitrogen25bpDNALadder,琼脂糖凝胶浓度为3%,最小片段选为 0bp 10 n 1213141516171819 = 标引序号说明: 泳道1 泳道1m Marker; Hpa 冰道2 Alu 泳道12 Hpal; BamH 泳道3 泳道13 Kpm 泳道4 泳道14 -Mbo Bfa 泳道5 BsU 泳道15 -Mse Rsa 泳道6 泳道16 Dra 泳道7 EcoRI; 泳道17” Ssp 泳道8 Hae; 泳道18Taqg 泳道9 泳道19 Hha Marker 泳道10 HinfI; 图c.1榆韧皮部坏死植原体虚拟RrLP指纹图谱
GB/40141?2021 lasmastrainsintheelm [1]Lee,I.M.,Martini,M.,Marcone,C.,etal.Classifieation ofphytopl yellowsgroup(16SrV) andproposalofCandidaws Phbytoplasma" ulmi'forthephytoplasmaassoeiat Micr ,2004,54(Pt2 rohology, ecdwithelmyellows.InternationalJournalosystematie&Evoluti ionaryl 337-347 Zhao,Y.,wei,w.,Lee,I.-M.,etal.Constructionofaninteractiveonlinephytoplasmaclassi ffeationtool,iPhyClasifer,anditsapplieationin.analysisfthepeadhXdiseasephytoplasmagtroup 16Sr).InternationalJournalofSystematie EvolutionaryMierobiology,2009,59Pt10) 2582-2593.

榆韧皮部坏死植原体检疫鉴定方法GB/T40141-2021解读

榆韧皮部坏死是由植原体引起的病害，因其危害性较大，在我国被列为检疫性有害生物。为了更好地防控该病害的传播和扩散，国家出台了相关标准，其中最新发布的就是GB/T40141-2021《榆韧皮部坏死植原体检疫鉴定方法》。

根据该标准，对于疑似感染榆韧皮部坏死的植物，可以采用PCR技术进行检测。具体流程如下：

1. 取样：在受疑似感染的部位，取一小块植物样品。
2. 提取DNA：使用相应试剂盒提取样品中的DNA。
3. PCR扩增：利用特异性引物进行PCR扩增，得到目标基因片段。
4. 电泳分析：将扩增产物进行电泳分析，判断其中是否存在与榆韧皮部坏死植原体相对应的DNA条带。

通过以上步骤，就可以初步确定样品中是否存在榆韧皮部坏死植原体。在实际操作中，还需要根据标准规定的阈值，对检测结果进行判定。

总之，GB/T40141-2021《榆韧皮部坏死植原体检疫鉴定方法》为植物检疫工作提供了技术规范，有助于及早发现和控制该病害的传播。

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2022/7/14 11:12:12 现行