GB/T40457-2021
咖啡浆果炭疽病菌检疫鉴定方法
DetectionandidentificationofColletotrichumkahawaeJ.M.Waller&Bridge
- 中国标准分类号（CCS）B16
- 国际标准分类号（ICS）65.020.01
- 实施日期2022-03-01
- 文件格式PDF
- 文本页数10页
- 文件大小5.28M
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咖啡浆果炭疽病菌检疫鉴定方法
国家标准 GB/T40457一2021 咖啡浆果炭痘病菌检疫鉴定方法 DeteetonandidentifrieationorColletotrichum J.M.waller&Bridge kalhaae 2021-08-20发布 2022-03-01实施 家市场监督管理总局 国 发布 国家标准花管委员会国家标准
GB/40457一2021 前 言 本文件按照GB/T1.1一2020<标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草
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本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口
本文件起草单位;宁波检验检疫科学技术研究院、科学院微生物研究所、天津 海关
本文件主要起草人:段维军、蔡磊、刘芳、李雪莲、张慧丽,赵鹏、廖芳、陈先锋
GB/40457一2021 咖啡浆果炭痘病菌检疫鉴定方法 范围 本文件描述了咖啡浆果炭痕病菌形态学和分子生物学特征的鉴定检测方法
本文件适用于携带咖啡浆果炭痘病菌的植物及其产品中咖啡浆果炭痘病菌的检测
规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件
术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义 分类信息 中文名;咖啡浆果炭痘病菌 学名:ColletotrichumkahaaeJ.M.waller&.Bridge 分类地位;真菌界(Fungi),子囊菌门(Ascomycota),盘菌亚门(Pezizomycotina),粪壳菌纲(Sordar iomycetes),肉座菌亚纲(Hypoereomycetidae),小丛壳目(Glonmerellales),小丛壳科(Glomerellaceae) 刺盘袍属(Colletotrichumn
分布、寄主传播途径等信息见附录A
鉴定原理 根据咖啡浆果炭痘病菌在寄主植物上的症状,抽取可疑样品进行病原菌分离培养,按照病原菌的形 态特征和实时荧光PCR特异性反应进行鉴定
仪器设备、器具,试剂和培养基 6.1仪器设备和器具 高压灭菌锅、显微镜、解剖镜、天平、,水浴锅、纯水仪,涡旋振荡器、高速冷冻离心机、冰箱,生化培养 箱,实时荧光PcR仪.紫外分光光度计,微量移液器(o.1l一25L.lAL一10L.I0l一50L 20 200AL、100AL~1000AL),研钵、锥形瓶、培养皿,载玻片,盖玻片,灭菌滤纸
l" 6.2试剂 十六婉基三甲基澳化铵(CTAB)提取液(2%CTAB，1.4mol/LNaCl，20mmol/儿LEDTA 100mmol/LTrisHClpH8.0)、三胫甲基氨基甲烧(Tris)饱和酚、三氯甲炖、异戊醇,异丙醉、75%乙 醇,RNA酶、超纯水,实时荧光聚合酶链式反应(RealtimePCR)反应预混液2×TaqManUniversal
GB/T40457一2021 PCRMasterMix(宜使用,亦可自行配制. 除另有规定外,所有试剂均为分析纯或生化试剂
6.3培养基 麦芽汁培养基(MEA);麦芽汁20g,蛋白陈3g,琼脂20g,加蒸僧水配制1L
配成溶液后121C 下灭菌20min. 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA);马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂粉20g,加燕僧水配制1L
配 成溶液后121C下灭菌20nmin. 检疫鉴定 7.1分离培养 切取发病材料病健交界处的植物组织(约0.3cm×0.3cm),用75%乙醇浸泡lmin进行表面消毒 无菌水冲洗3次后置于灭菌滤纸上,吸干水分后放置于倒有麦芽汁培养基(MEA)的培养皿中
培养 放置在温度为25C条件下光照培养箱中培养(光照和黑暗各12h交替)
培养4d~6d后,挑取可疑 菌落边缘的菌丝进行纯化培养
7.2形态学观察 显微镜观察弛子的形态特征、产袍方式
观察记录菌落的直径,颜色、分生抱子和附着胞的形成情 况等(见图A.2)
7.3DNA制备 DNA制备按照附录B的方法提取
7.4NA纯度与浓度的测定 nm和280nm处的吸收值,计为 用紫外分光光度计测定DNA的纯度与浓度,分别读取260 OD .oD.m
DNA的纯度oD./oD比值应为1.7一1.9,DNA的浓度为50倍的oD.(9g/mL). DNA的浓度与纯度应符合实时荧光聚合酶链式反应(ReatimePCR)检测的要求
7.5实时荧光PCR检测 实时荧光聚合酶链式反应(RealtimePCR)方法按照附录C的方法检测
8 鉴定特征 8.1症状 该病害可以发生在咖啡树生长的所有阶段,主要危害咖啡浆果,造成果实脱落,偶尔侵染叶片
浆 果表面初时呈现近圆形水渎状小斑点,后病斑变成凹陷,暗褐色至灰黑色大病斑,其上长出粉红色黏液 状物
病叶上可见褐色炭痘状病斑,其上有许多黑色小点(病原菌的分生抱子)排列成同心轮纹(见 图A.1. 8.2鉴定特征 在温度为25下,咖啡浆果炭痕菌培养物在2%麦芽汁培养基(MEA)平板上生长7d后,菌落直
GB/40457一2021 径可达14mm~28mm,正面灰色至深橄榄灰色,背面深绿色
继代培养的菌落的颜色发生变化,多为 灰白色或棕色
分生抱子着生于菌丝上,直立,圆柱形,无分隔,两端钝圆,(12.54m19m)X 4 一9.5 1×5.5 一6.5m)见 1一5m)
附着胞浅褐色至褐色,圆形或不规则.(8m一 Am Am Mm 图A.2) 8.3实时荧光CR鉴定 在阴性对照、空白对照正常的情况,则有如下判定 -样品无Ct值并且无扩增曲线,判定为阴性; -样品Ct值<35.0,且出现典型的扩增曲线,判定为阳性 样品Ct值在35.040.0之间时,应重新提取样品DNA进行扩增检测
重做Ct值大于40,判 为阴性;否则判为阳性; -样品Ct值大于40时,判定为阴性
结果判定 若症状明显符合8.1鉴定特征，且培养物培养特征符合8.2鉴定特征,判定为检出咖啡浆果炭痕 病菌
若症状不明显,但培养物培养特征符合8.2鉴定特征,且实时荧光PCR检测结果为阳性,判定为检 出咖啡浆果炭痘病菌
0样品保存、记录与复核 10.1样品保存、记录 保存样品应置于2C8C冰箱妥善保存,对检出咖啡浆果炭痘病菌的样品应至少保存6个月
菌株保存于4C冷藏箱,核酸样品保存于一20C或一80C冰箱
以备复检,谈判和仲裁
分离到的咖啡浆果炭痘病菌应接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基中妥善保存
记录包括:样品的来源、种类、采样时间、检测时间、地点,方法、结果等,并有试验人员的签字
实时 荧光PCR要有检测阳性结果照片
10.2复核 由指定的单位或人员负责,主要考察试验原始数据记录及实时荧光PCR结果等资料的完整性和真 实性,必要时进行复核试验
GB/T40457一2021 附 录 A 资料性) 咖啡浆果炭痕病菌基本信息 地理分布 A.1 非洲:安哥拉、布隆迪、喀麦隆、中非共和国、刚果(金、埃塞俄比亚、肯尼亚、马拉维、莫桑比克、卢旺 达,南非,坦桑尼亚、乌干达、赞比亚、津巴布韦
中美洲:古巴
欧洲;意大利
A.2寄主 咖啡,包括小粒种Coffea.arabica、中粒种Coffeacanephor和大粒种Cofeaiberica
？ 传播途径 A.3 染病浆果为初侵染源,也可借助人类耕作活动、鸟类、昆虫、雨水等进行传播,远距离传播通过带病 植株相关贸易进行传播
A.4危害情况 咖啡浆果炭痕病是一种毁灭性的病害,主要危害小粒种咖啡的绿色浆果和叶片,极易造成果实脱 落,并可使咖啡果实产量损失50%80%
浆果表面初时呈现近圆形水溃状小斑点,后病斑变成凹陷 暗褐色至灰黑色大病斑,其上长出粉红色黏液状物(见图A.l)
图A.1咖啡浆果炭痘病菌危害咖啡叶片和浆果的病害症状引自Wallereal.1993 A.5形态特征 咖啡浆果炭痘病菌培养物形态特征图见图A.2
GB/40457一2021 说明 AB 附着胞 分生抱子 D~F -不同菌株在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)上培养10d的菌落形态,上为正面、下为反面
注.c上标尺为20m,适用于A~B. 图A.2咖啡浆果炭痕病菌的形态特征(引自Weiretal.2012)
GB/T40457一2021 录 附 B 规范性 十六炕基三甲基溴化铵(CIAB)提取DNA方法 B.1收集培养分离得到的菌丝或植物材料放人1.5mL离心管中,加人0.2g石英砂或4粒5粒玻璃 珠和100L十六熔基三甲基澳化铵(CTAB)抽提液,用破碎仪或无菌玻璃杵碾碎菌丝体或植物材料
B.2加人5004L65C预热的cTAB抽提液,颠倒混匀后于65C水浴0.5h1h
B.3冷却至室温后,12000r/min离心10min,取上清液至另一离心管中
B.4加人1/2体积(300L)的三胫甲基氨基甲婉(Tris)饱和酚及1/2体积(300L)的氯仿:异戊醉 24;1),颠倒混匀后静置至其开始分层
B.512000r/min离心10min,取上清液至另一离心管中 B.6可重复B4至B.5步2次3次,视两相界面处杂质的多少而定
B.7加人等体积氯仿:异戊醇醉(24:1),轻轻颠倒混匀
B.812000r/min离心10min,取上清液至另一离心管中
B.9向上清液中加人等体积异丙醇,轻轻颠倒混合均匀后于4C或一20C沉淀1h
B.1012000r/min离心10min,弃去上清液,加500AL70%乙醇悬浮沉淀
B.1112000r/min离心5min,弃上清,室温干燥
B.12加50AL无菌水或三羚甲基氨基甲烧乙二胺四乙酸(Tri、EDTA,TE)缓冲液[配方;1mol几 Tris-HCIpH8.0)1mL ,0.5mol/LEDTApH8.00.2mL,加超纯水定容至100mL]溶解沉淀， -20C贮存备用
GB/40457一2021 录 附 C 规范性 实时荧光CR方法 引物及探针序列 C.1 正向引物CK-GF;5'-CTGCATcTGGTAGACAAGAAGGT-3' 反向引物CK-GR:5'-AGAGcGAGTCAGTAAATGTGACAG3' 探针cK.GP.5-cccATGATTTcAATTcAcATcAAGTcAAG3 TaqMan探针(CK-GP)采用5'末端FAM(6-carboxyfluorescein)标记作为荧光报告染料,3'末端 TAMRA(6-earboxytetranmethhylrhodanmine)标记作为荧光淬灭染料
c.2反应体系 rCR扩增反应体系(总体积为25L)2XTuqManUmversalPCRMaserMix12.5pL.引物cK GF/CK-GR各0.4Mmol/L探针CK-GP0.24mol/L,DNA模板2AL,加人去离子水补齐25AL
将反 应体系混合均匀后置于荧光PCR仪中进行反应
以咖啡浆果炭痘病菌DNA作阳性对照,不含咖啡浆果炭痘病菌的DNA作阴性对照、以无菌蒸僧 水作空白对照,每个样品设置3个重复
C.3扩增条件 反应条件为:95C10min;然后94C15s,60C60s,共40个循环
GB/T40457一2021 参 考 文 献 ]caiL，HydKD，TaylorPwI，weirBS，w.Aler了，AhbungMM，AhaungJZ，Yang Phouliv gS，LiuZY，PrihastutiH,ShivasRG，MeKenzieEHC,JohnstonPR2009Apolyphasie vong approaehforstudyingCaetotrihumn. FungalDivers39;183-204 [2]CannonPF，DammU,JohnstonPR，WeirEBS2012)Colletotrichum-currentstatusandfu turedirections.StudMycol73:181-213. [3]LiuF，WeirB，Dan CrousPW，WangY，LiuB，WangM，ZhangM，CaiL2015 )amm UnravelingColleotrichuspeciesassoeciatedwithCamellia:employingApMatandGsloci resolvespeciesinthe gloeosporioilescomplexPersoonia35:63-86. PrihastutiH，CaiL，ChenH，HydeKD2009CharacterizationofColletotrichumspecies assoeiatedwithcoffeeberriesinChiangMai，Thailand
FungalDivers39;89-109. P SantammariaJ，Bayman 2005FungalepiphytesandendophytesofcoffeeleavesCoffea arabica).MierobEcol50;1-8. [6SilvaDN，TalhinhasP，VarzeaV，CaiI，PauloOS，BatistaD2012Applicationofthe Apn2/MATlocustoimprovethesystematicsoftheColletotrichumgloeosorioidescomplex:anex amplefromcoffee spp.hosts
Mycologia104;396-409. [7]SreenivasaprasadS，BrownAE，MllsPR(1993CoffeeBerryDiseasepathogeninAfrica: geneticstructureandrelationshiptothegroupspeciesColletotrichumgloeosporioies
MycolRes87: 995-1000. [8]TaoG，HydeKD，CaiL2012Speeies-specifiereal-timePCRdetectionofCollelotrichum kah4wae.」ApplMicrobiol1143):828-835. [9]wallerJw，BridgePD，BlackR，HakizaG(1993)Characterizationofthecoffeeberry diseasepathogens，Colletotrichumkahauaespnov.MycolRes97:989-994. [[10]weirB.JohnstonPR，Damm" U 2012)TheColletorichumgoeosorioidesspeciescom plex.StudMycol73;l15-18o [11]陶刚，蔡磊
一种咖啡浆果炭痘病菌快速分子检测试剂盒及其应用
国家发明专利，2012，专 利号;Z1201210044952.4
咖啡浆果炭疽病菌检疫鉴定方法GB/T40457-2021
咖啡浆果是全球著名的高档咖啡品种之一，具有香气浓郁、口感细腻等特点。然而，咖啡浆果也容易受到炭疽病菌的侵害，导致咖啡产量和品质下降。
为了保证咖啡贸易的顺利进行，GB/T40457-2021咖啡浆果炭疽病菌检疫鉴定方法应运而生。该标准针对咖啡浆果中常见的炭疽病菌进行检测，旨在提供一种准确、快捷、可靠的检测方法，保障咖啡贸易的安全与稳定。
GB/T40457-2021标准主要包括样品采集、预处理、DNA提取和PCR扩增等步骤。具体来说，样品采集需要选择健康、成熟、无根腐病的咖啡浆果作为检测对象；预处理则需要将浆果表面清洗干净，并进行消毒处理；DNA提取则需要利用特定的试剂盒进行提取，并进行纯化、浓缩和定量等处理；最后，PCR扩增则需要使用特定的引物和酶，在特定条件下进行扩增反应。
总的来说，GB/T40457-2021标准在咖啡浆果炭疽病菌检测中具有重要意义。其能够提供一种高效、准确、可靠的检测方法，为咖啡产业的发展提供了保障。
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