猪源链球菌通用荧光PCR检测方法

猪源链球菌通用荧光PCR检测方法

国家标准 GB/T19915.6一2005 猪源链球菌通用荧光PCR检测方法 Methodofthereal-tierCRforthedeteetionofStrept ccussuuis o 2005-11-01实施 2005-09-27发布 国家质量监督检验检疫总局 发布 中 国国家标准化管委员会国家标准
GB/T19915.6一2005 猪源链球菌通用荧光PCR检测方法 范围 本标准规定了猪源链球菌通用荧光PCR检测方法 本标准适用于增菌培养物、疑似病料及生猪拭子、猪组织样品中猪源链球菌的检测 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T19438.1一2004禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法 缩略语 本标准采用下列缩略语: 荧光PCR荧光聚合酶链式反应 C值 每个反应管内的荧光信号量达到设定的值时所经历的循环圈数 脱氧核糖核酸 DNA Taq酶 TaqDNA聚合酶 PBS 磷酸盐缓冲生理盐水 原理 采用TaMan方法,在比对猪颜链球菌1ssDNA基因序列的基础上,设计针对该基因的特异性引 物和特异性的荧光双标记探针进行配对 探针5'端标记FAM荧光素为报告荧光基团(用R表示). 3'端标记TAMRA荧光素为淬灭荧光基团(用Q表示),它在近距离内能吸收5'端荧光基团发出的荧光 信号 PCR反应进人退火阶段时,引物和探针同时与目的基因片段结合,此时探针上R基团发出的荻 光信号被Q基团所吸收,仪器检测不到荧光信号;而反应进行到延伸阶段时,Taq酶的5'--3'的外切核 酸酶功能将探针降解 这样探针上的R基团游离出来,所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接 收 随着PCR反应的循环进行,PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系 猪源链球菌通用荧光PCR检测实验室的标准化设置与管理 猪源链球菌通用荧光PCR检测实验室的标准化设置与管理见GB/T19438.1一2004中附录C 试剂和材料 6.1试剂 除另有说明,所用试剂均为分析纯 6.1.1无水乙醇;一20C预冷 6.1.275%乙醇,用新开启的无水乙醇和无DNA酶的灭菌纯化水配制.一20C预冷 6.1.30.01mol/LpH7.2的PBS;配方见附录A,(121士2)C、15min高压灭菌冷却
GB/T19915.6一2005 6.1.4猪源链球菌通用荧光PCR检测试剂盒':试剂盒的组成、说明及使用注意事项参见附录B 6.2仪器设备 6.2.1高速台式冷冻离心机;最大转速13000r/min以上 6.2.2荧光PCR检测仪、计算机 6.2.32C8C冰箱和一20C冰箱 6.2.4微量移液器;0.5lL~10L.5l一20L,20L一200lL,200l~1000L 6 .2.5组织匀浆器 .2.6混匀器 6 样品的采集与前处理 采样过程中样本不得交叉污染,采样及样品前处理过程中须戴一次性手套 7.1取样工具 7.1.1棉拭子,剪刀、慑子、研钵,Eppendor管 7.1.2所有上述取样工具应经(121士2)C、,15min高压灭菌并烘干或经160C干烤2h 7.2采样方法 7.2.1生猪拭子样品 咽喉拭子采样,采样时要将拭子深人喉头及上聘来回刮3次一5次,取咽喉分泌液 7.2.2扁桃体、内脏或肌肉样品 用无菌的剪刀和锻子剪取待检样品1.0g于研钵中充分研磨,再加5.0mlPIBS混匀,然后将组织 悬液转人无菌Eppendorf管中,编号备用 7.2.3血清或血浆 用无菌注射器直接吸取至无菌Eppendo管中,编号备用 7.3存放与运送 采集或处理的样本在2C8C条件下保存应不超过24h;若需长期保存,须放置一70C冰箱,但应 避免反复冻融(最多冻融3次) 采集的样品密封后,采用保温壶或保温桶加冰密封,尽快运送到实 验室 操作方法 样本核酸的提取 在样本处理区进行 8.1.1提取方法1 8.1.1.1取n个1.5ml灭菌Eppendor管,其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之 和,对每个管进行编号标记 8.1.1.2每管加人1.0ml裂解液,然后分别加人待测样本,阴性对照和阳性对照各100l，一份样本 换用一个吸头,混匀器上震荡混匀5s,于4C25C条件下,10000r/min离心10min. 8.1.1.3取与8.1.1.1中相同数量的1.5ml灭菌Eppendorf管,加人500L无水乙醇(一20C预 冷),对每个管进行编号 吸取8.1.1.2离心后各管中的上清液转移至相应的管中,上清液要充分吸取， 不要吸出底部沉淀,颠倒混匀 8. 1.1.4于4C25C条件下,5000r/min离心5min(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放 置 轻轻倒去上清,倒置于吸水纸上,吸干液体,不同样品应在吸水纸不同地方吸干 加人1.0ml 由指定单位提供,给出这一信息是为了方便本标准的使用者,并不表示对该产品的认可 如果其他等效产品具 有相同的效果,则可使用这些等效产品
GB/T19915.6一2005 75%乙醇,颠倒洗涤 8. 1.1.5于4C一25C条件下,5000r/min离心10nmin(Eppendor管开口保持朝离心机转轴方向放 置) 轻轻倒去上清液,倒置于吸水纸上,吸干液体,不同样品应在吸水纸不同地方吸干 8.1.1.64000r/min离心10s,将管壁上的残余液体甩到管底部,用微量加样器尽量将其吸干,一份 样本换用一个吸头,吸头不要碰到有沉淀一面,室温干燥5s15s 不宜过于干燥,以免DNA不溶 8.1.1.7加人11lL无DNA酶的灭菌纯化水,轻轻混匀,溶解管壁上的DNA,2000r/min离心5s 冰上保存备用 8.1.2提取方法2 .1.2.1取n个1.5mL灭菌Ependorl管,其中为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之 和,对每个管进行编号标记 8.1.2.2每管加人100LDNA提取液1,然后分别加人待测样本、阴性对照和阳性对照各100L,一 份样本换用一个吸头,混匀器上震荡混匀5s,于4C25C条件下,13000r/min离心10min. 8.1.2.3尽可能吸弃上清且不碰沉淀,再加人10aLDNA提取液2.混匀器上震荡混匀5s 于4C 25C条件下,2000r/nmin离心10s 00C干浴或沸水浴10min;加人40L无DNA酶的灭菌纯化水,13000!/min离心10min, 8.1.2.4 上清即为提取的DNA,冰上保存备用 8.1.3DNA提取后的处理要求 提取的DNA须在2h内进行PCR扩增或放置于一70C冰箱 8.2扩增试剂准备与配制 在反应混合物配制区进行 从试剂盒中取出猪源链球酋酒用荧光R反应液.了叫孵.在室温下融化后.2oormn离心5 设所需CR数为n,其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和 每个测试反应体系需 使用15L.PCR反应液及0.3AlLTa酶 计算各试剂的使用量,加人一适当体积试管中,向每个PCR 管中各分装15L,转移至样本处理区 8.3加样 在样本处理区进行 在各设定的PCR管中分别加人8.1.1.7或者8.1.2.4中制备的DNA溶液 0L,使总体积达25lL 盖紧管盖后,500r/in离心30s 8.4荧光PCR反应 在检测区进行 将8.3中加样后的PCR管放人荧光PCR检测仪内,记录样本摆放顺序 反应参数设置: 第一阶段,预变性92C3nmin; 第二阶段,92C5s,60C30s,45个循环,荧光收集设置在第二阶段每次循环的退火延伸时进 行 结果判定 9.1结果分析条件设定 读取检测结果 值设定原则以值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点,不同仪器可 根据仪器噪音情况进行调整 9.2质控标准 阴性对照无C值并且无扩增曲线 9.2.1 9.2. 2 阳性对照的C值应<30.0,并出现特定的扩增曲线 2.3如阴性对照和阳性条件不满足以上条件,此次实验视为无效 9.
GB/T19915.6一2005 9.3结果描述及判定 9.3.1阴性 无C值并且无扩增曲线,表明样品中无猪源链球菌 9.3.2阳性 C值30.0,且出现特定的扩增曲线,表示样本中存在猪源链球菌
GB/T19915.6一2005 附 录 A 规范性附录 磷酸盐缓冲生理盐水配方 A.1A液(0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液) -水合磷酸二氢钠(NaH,POH.O)27.6g,溶于蒸馏水中,最后稀释至1000mL A.2B液(0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液) 七水合磷酸氢二销(NaHrO 7H,O)53.6g,[或十二水合磷酸氢二钠(NaHPO 12H.o) 1.6最或二水合酸复二纳八NaHro2H.o35.见加熬溜水游解,最后稀释至1000ml. a.01m/L.,pln7.2确酸盐缓冲生理盐水的配制 A.3 0.2mol/LA液 14ml 0.2nmol/LB液 36ml 氯化钠 8.5g 用燕馏水稀释至1000ml
GB/T19915.6一2005 附 录 B 资料性附录 猪源链球菌通用荧光CR试剂盒组成、说明及使用时的注意事项 B.1试剂盒的组成 试剂盒的组成见表B.1 表B.1猪源链球菌通用荧光CR试剂盒的组成 组成48tests/盒 数 量 48ml×1盒(裂解液)或 裂解液(提取方法1)或DNA提取液1(提取方法2),DNA 5ml X1管(DNA提取液1) 提取液2(提取方法2) 1.6mlX1管(DNA提取液2)y 猪源链球菌通用荧光P(CR反应液 750LX1管 Tauq酶(5U/L) 5LX1管 无DNA酶的灭菌纯化水 1mL×1管 阴性对照 1mlx1管 阳性对照 mLX1管 B.2说明 B.2.1裂解液外观为浅绿色.于4C保存;DNA提取液1,2为无色液体,一20C保存 B .2.2无DNA酶的灭菌纯化水,用于溶解提取的DNA B.2.3PCR反应液中含有特异性引物、探针及各种离子 B.3使用时的注意事项 B.3.1由于阳性样品中模板浓度相对较高,检测过程中不得交叉污染 B.3.2反应液分装时应尽量避免产生气泡,上机前注意检查各反应管是否盖紧,以免荧光物质泄漏污 染仪器 B.3.3除裂解液外,其他试剂一20C保存,有效期为6个月