蜂王浆中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素残留量的测定液相色谱-串联质谱法

蜂王浆中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素残留量的测定液相色谱-串联质谱法

国家标准 GB/T22945一2008 蜂王浆中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素 残留量的测定液相色谱-串联质谱法 Determinationofstreptomyein,dihydrostreptomyein andkanamyeinresiduesinroyaljelly一LC-MS-MSmethod 2008-12-31发布 2009-05-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T22945一2008 前 言 本标准的附录A、附录B为资料性附录 本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口 本标准起草单位;秦皇岛出人境检验检疫局 本标准主要起草人:刘晓茂、张守军、张进杰、曹彦忠、曹亚平、孙海侠、庞国芳
GB/T22945一2008 蜂王浆中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素 残留量的测定液相色谱-串联质谱法 范围 本标准规定了蜂王浆中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素残留量液相色谱-串联质谱测定方法 本标准适用于蜂王浆中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素残留量的测定 本标准的方法检出限;链霉素,双氢链霉素和卡那霉素的检出限均为10.04g/kg 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度正确度与精密度第1部分:总则与定义 GB/T6379.1一2004,ISO5725-1:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度(正确度与精密度第2部分;确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法(GB/T6379.2一2004,ISO5725-2;1994,IDT) GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T66822008,ISO3696:1987,MOD) 原理 蝉王浆试样中的抗生素用磷酸溶液提取,三氯乙酸沉淀蛋白,用苯磺酸型和梭酸型固相萃取柱净 化 液相色谱-串联质谱仪(ESI+)检测,外标法定量 试剂和材料 除另有说明外,所用试剂均为优级纯 4.1水:GB/T6682,一级 甲醇:色谱纯 4 2 4.3乙睛;色谱纯 4.4甲酸 4.5浓磷酸 4.6磷酸氢二钾(K.HP()) 三氯乙酸(CHCI,O.) 4.8庚婉磺酸纳(CHNaOSH.O). 4.95%磷酸溶液(1+19);取50ml浓磷酸(4.5),用水定容至1L 4.100.2mol/L磷酸盐缓冲溶液:pH=8.5 称取34.8g磷酸氢二钾(4.6)用水溶解,定容至1L,用 氢氧化钠溶液调节pH=8.5 4.11三氯乙酸溶液;50%质量分数) 取20g三氯乙酸(4.7),用水定容至20ml 4.120.01mol/儿庚烧碱酸钠溶液;称取2.20g庚婉碱酸钠(4.8),用水溶解,定容至1L 4.13SPE洗脱溶液;取4ml甲酸(4.4),用0.01mol/L庚婉碱酸钠溶液(4.12)定容至100ml 4.1425%甲醉溶液I十3);取25ml甲醉(4.2),用水定容至100ml
GB/T22945一2008 4.15标准物质;链霉素(CAS:3810-74-0),双氢链霉素(CAS:128-46-1)和卡那霉素(CAS;25389-94-0),纯 度均98% 4.161.0mg/ml标准储备溶液:称取适量的链霉素、双氢链霉素和卡那霉素标准物质(4.15),分别用 0.3%乙酸水溶液溶解并配制成1.0mg/mL的标准储备溶液 避光保存于一18C冰柜中 4.170.1g/ml混合标准溶液;吸取适量链霉素,双氢链霉素和卡那霉素标准储备溶液(4.16),用 0.3%乙酸水稀释成0.1g/mL的混合标准溶液,避光保存于-18C冰柜中 4.18苯碱酸型固相萃取柱(500mg,3ml)或相当者 使用前依次用5ml.甲醉和10ml水预处理、 保持柱体湿润 4.19拨酸型固相萃取柱(500mg,3ml)或相当者 使用前依次用5ml甲醇和10ml水预处理,保 持柱体湿润 4.20滤膜:0.2Am. 仪器 5.1液相色谱-串联四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源 5.2分析天平;感量0.1 mg和0.01g 5.3液体混匀器 5.4固相萃取装置 5. 均质器 5.6真空系真空度应达到0ka 5了 微量注射器;25aL,100L 5.&pH计;测量精度土0.02pH单位 5.9具塞离心管;100mL 55 .10刻度离心管;5mL 5.11贮液器:50mL 12 离心机:转速4000r/min以上 试样的制备与保存 6.1试样的制备 实验室样品混合均匀,分出0.5kg作为试样 6 试样保存 试样置于一18C冰柜,避光保存 测定步骤 待测样品溶液的制备 7 1.1样品提取和初净化 称取蜂王浆样品10g(精确到0.01g),置于100ml离心管中,加人30mL5%磷酸溶液(4.9),均 质3min并用5%磷酸溶液清洗均质器刀头,合并洗涤液,加人3mL三氯乙酸溶液(4.11)涡旋混合后 在4000r/min下离心10min 上清液全部倒人下接苯磺酸型固相萃取柱(4.18)的贮液器中,在固相 萃取装置上使样液以小于2mL/min的流速通过萃取柱,待样液全部通过固相萃取柱后,依次用5mL 5%磷酸溶液(4.9)和10ml.水洗涤苯碱酸型固相萃取柱(4.18),弃去全部流出液 用20ml磷酸盐缓 冲溶液(4.l0)洗脱至50ml.离心管中 样品溶液再净化 上述洗脱液倒人下接拨酸型固相萃取柱(4.19)的贮液器中,在固相萃取装置上使样液以小于
GB/T22945一2008 2mL/min的流速通过萃取柱,待样液全部通过固相萃取柱后,依次用10mL水和10mL甲醇溶液 4.l4)洗涤梭酸型固相萃取柱(4.19),弃去全部流出液 减压抽干拨酸型固相萃取柱(4.19)30min. ,混匀后 用2mLSPE洗脱液(4.13)洗脱至5ml刻度离心管中,用sPE洗脱液(4.13)定容至2.0" m L 过0.2m滤膜(4.20),供液相色谱-串联质谱测定 7.2基质混合标准校准溶液的制备 称取五个阴性蜂王浆样品10g(精确到0.01g),分别置于100m具塞离心管中,加人适量混合标 准溶液(4.17),制成链霉素,双氢链霉素和卡那霉素含量均为5.04g/kg,l0.04g/kg,20.04g/kg、 100.0g/kg和200.04g/kg的基质标准溶液 其余按7.1步骤操作完成 7.3测定条件 7.3.1液相色谱参考条件 色谱柱;AlantisC,3.5Am,150mm×2.1mm(内径)或相当者; a b)柱温;40C; e)进样量:30nL; 流动相;流动相A为0.1%甲酸水溶液,流动相B为0.1%甲酸乙腊溶液,流动相c为甲醇 d 梯度洗脱参考条件见表1 表1液相色谱梯度洗脱参考条件 时间/minm 流动相A/% 流速/L/min) 流动相B/% 流动相C/% 200 85 10 3.01 200 60 35 S 6.00 200 35 6.01 200 85 10 16.00 200 85 10 7.3.2质谱参考条件 a 离子源;电喷雾离子源(EsI); b)扫描方式:正离子扫描; 检测方式;多反应监测(MRM); c D 电喷雾电压(IS):5000V; 辅助气(AUX)流速:7L/min fD 辅助气温度(TEM)550C; 聚焦电压(FP):150V g h)链霉素,双氢链霉素和卡那霉素的质谱参数见表2 表2链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的质谱参数 定量离子对 去簇电压(DP)y 采集时间 碰撞气能量(CE) 化合物名称 定性离子对(m/: m/e) mms 582/263 链霉素 4! 582/263 10 100 6 streptomyein 582/246 双氢链霉素 584/263 43 584/263 100 100 kdihydrostreptonycin 584/246 55 卡那霉素 485/163 34 485/163 100 50 kanamyein 485/324 23
GB/T22945一2008 7.4液相色谱-串联质谱测定 7.4.1定性确证 每种被测组分选择1个母离子,2个以上子离子,在相同试验条件下,样品中待测物质的保留时间 与混合基质标准校准溶液中对应组分的保留时间偏差在士2.5%之内;且样品谱图中各组分的相对离子 丰度与浓度接近的混合基质标准校准溶液谐图中对应的相对离子丰度进行比较,偏差不超过表3规定 的范围,则可判定样品中存在对应的待测物 表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 以%表示 相对离子丰度K K50 20K50 10K20 Ksl0 士25 士5o 允许最大偏差 士20 士30 7.4 定量测定 2 外标法定量;在仪器最佳工作条件下,对链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的混合基质标准校准溶液 进样测定,以混合基质标准校准溶液浓度为横坐标,以峰面积为纵坐标,绘制标准工作曲线,用标准工作 曲线对待测样品进行定量,样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内 链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的多反应监测(MRM)色谐图参见附录A中的图A.1 链霉素、双 氢链霉素和卡那霉素的添加浓度及其平均回收率的试验数据参见附录B中的表B.1 7.5平行试验 按以上步骤,对同一试样进行平行试验测定 7.6空白试验 不称取样品,其余均按试样步骤进行 7.7回收率试验 阴性样品中漆加标准游液.按了.1和7.2操作,测定后计算样品漆加的回收率 结果计算 链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的残留量按式(1)计算 1000 X= c× mn 000 式中: 试样中被测组分残留量,单位为微克每千克(4g/kg); -从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL); 样品溶液最终定容体积,单位为毫升(mL); 样品溶液所代表最终试样的质量,单位为克(g) 71 计算结果应扣除空白值 精密度 9.1 一般规定 本标准的精密度数据是按GB/T6379.1和GB/T6379.2规定确定的,重复性和再现性的值以 5%的可信度来计算 9.2重复性 在重复性试验条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限厂 链霉素、双氢链霉 素和卡那霉素的添加浓度范围及重复性方程见表4
GB/T22945一2008 表4添加浓度范围及重复性和再现性方程 单位为微克每千克 化合物名称 添加浓度范围 重复性限r 再现性限R 链霉素 5.0一200.0 lgr=1.1244lgm一1.0316 lgR=1.1401lgm-1.0213 一1.37n- 1.0162 .0232kw-价.38 双氧链霉素 5.0200.0 lgR=1." 5.0200.0 lgr=0.981olgm-1.0029 lgR=0.9953lgm-0.9844 卡那霉素 注:m为两次测定结果的算术平均值 如果差值超过重复性限r,应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定 9.3再现性 在再现性试验条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R 链霉素、双氢链霉 素和卡那霉素的添加浓度范围及再现性方程见表4
GB/T22945?2008 ?A ?? ??(NR)?? ù??ù??ù????(MRM)???A.1 15000 9.12 ù 82/263 12000 9000 6000 3000 12 16 l/min 6000 9.12 ?ù 5000 584/263 4000 3000 200o 1000 16i/mmin 30000 9.30 ? 25000 485/63 20000 15000 10000 5000 16t/min ?A.1ù??ù??ù????(MRM)??
GB/T22945一2008 附 录 B 资料性附录 回 收 率 链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的添加浓度及其平均回收率的试验数据见表B.1 表B.1链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的添加浓度及其平均添加回收率 蜂蜜样品中链霉素、双氧链霉素和卡那霉素的平均回收率/% 添加浓度 g/kg 链霉素 双氢链霉素 卡那霉素 5.0 94.40 96,66 95.80 10.0 92.74 93.55 94.74 94.73 20.0 94.81 94.49 93.40 94.47 95,44 50.0