饲用纤维素酶活性的测定滤纸法

饲用纤维素酶活性的测定滤纸法

国家标准 GB/T23881一2009 饲用纤维素酶活性的测定 滤纸法 Determinationoffeedcelulaseaetivity Fiterpaperassaymethod 2009-05-26发布 2009-10-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T23881一2009 饲用纤维素酶活性的测定 滤纸法 范围 本标准规定了以滤纸为底物,用还原糖比色法测定饲用纤维素酶活性的方法 本标准适用于饲用纤维素酶活性的测定,定量检测限为0.02U/ml 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6682分析实验用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样 GB/T20195动物饲料试样的制备 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 3.1 滤纸纤维素酶活性单位filterpapercelulaseaetivityunit 在37,pH5.5,反应60min的条件下,每分钟降解滤纸释放1Amol葡萄糖所需的酶量,定义为 个滤纸纤维素酶活性单位,以U表示 原理 纤维素酶水解滤纸产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸还原 生成棕红色的氨基化合物,在540nm波长处有最大吸收,在一定范围内酶解产生的还原糖的量与反应 液的吸光值成正比 试剂和材料 本标准使用的试剂均为分析纯,水均为符合GB/T6682中规定的二级水 5.1酒石酸钾钠(c,H,KNaO4H.O). 5.2苯酌 5.3亚硫酸钠 5.4氢氧化钠溶液(200g/L),称取氢氧化钠20.0g,加100mL水溶解 5.5柠檬酸溶液(0.1mol/L);称取柠檬酸(CH.,OH,O)2.10g,加水溶解定容至100mL 5.6 柠橡酸的游被(a.1naL)称取柠橡股的(Na.cHo 2H.O)2.94g,加水溶解定容至 100mL 柠檬酸盐级冲液(0.05mol/L,pH5.5)称取柠檬酸(C,H,O, H,O)10.5g,加人氢氧化钠5.0g" 再加800ml水溶解,用柠檬酸溶液(5.5)或柠檬酸钠溶液(5.6)调节pH至5.5,再用水定容至 1000ml
GB/T23881一2009 5.8whatman1号滤纸条(1.0cm×6.0cm) 5.9DNS试剂称取3,5-二硝基水杨酸3.15g,加水500mL搅拌溶解,水浴至45C,然后逐步加人氢 氧化钠溶液(5.4)100ml,同时不断搅拌,直至完全溶解,再逐步加人酒石酸钾钠(5.1)91.0g,苯盼 (5.2)2.50g和亚硫酸钠(5.3)2.50g,搅拌至溶解,冷却到室温后,定容至1000ml 过滤,取滤液贮 存于棕色瓶中,避光保存 室温下存放7d后可以使用,有效期为6个月 警告:处理酸碱和配制DNNS试剂时,应在通风橱或通风良好的房间进行,戴上保护眼镜和乳胶手 套,一旦皮肤或眼睛接触了上述物质,及时用大量的水冲洗 5.10葡萄糖标准溶液(10.0mg/mL)称取经105C烘至恒量的无水葡萄糖约1g,精确至0.0001g 加柠檬酸盐缓冲溶液(5.7)溶解,定容至100ml 6 仪器与设备 除常用实验室设备外,其他仪器设备如下 6.1分样筛;孔径为0.25mm(60目. 6.2分析天平:;感量为0.0001 g 6.3pH计:精确至0.01 6.4磁力搅拌器;附加热功能 6.5电磁振荡器 6. 离心机 a， 恒温水浴锅 6.8秒表 6. 分光光度计 6. ..10移液器;精度为1L 试样的制备 按GB/T14699.1采样,按GB/T20195选取样品至少500g,四分法缩减至100g,磨碎,通过 0.25mm孔筛,混匀密闭容器中,低温保存 测定 8.1试样溶液的准备 称取0.2g一4【试样,精确至0.0001g,加人40mL柠檬酸盐缓冲液(5.7),磁力搅拌30min,再 用柠檬酸盐缓冲液(5.7)定容至100tmL,在4C条件下避光保存24h 摇匀,取30nmL一50mL,以 3000r/min离心3min 取5.00mL上清液,用柠檬酸盐缓冲液(5.7)做二次稀释(稀释后的待测酶液 中纤维素酶活性应控制在0.04U/mL~0.18U/ml之间 液体样品可以直接用柠檬酸盐缓冲液(5.7)进行稀释,定容(稀释后的酶液中纤维素酶活性应控制 在0.04U/mL0.18U/mL之间) 如果稀释后的酶液pH偏离5.5,需重新调节pH为5.5,用柠檬 酸盐缓冲液(5.7)稀释定容 88 2 标准曲线 .2.1分别量取葡萄糖标准溶液(5.10)0.00m,2.00mL、3.00mL、4.00ml6.00m,8.00mL 8 10.00 mL,分别用柠檬酸盐缓冲溶液(5.7)定容至50mL,配成浓度为0.00mg/mL~2.00mg/mL的 葡萄糖标准系列 8.2.2分别吸取葡萄糖标准溶液(8.2.1)各1.00ml于25ml容量瓶中,各加2.00ml水和2.00ml DNS试剂(5.9),沸水浴51 min 冷却至室温,用水定容至25ml,在540nm波长下比色,以吸光度作横 坐标,对应标准葡萄糖溶液含糖的毫克数为纵坐标,列出直线回归方程
GB/T23881一2009 8.3酶活性的测定 8.3.1吸取10.0ml经过适当稀释的酶液(8.1),37C平衡10nmin 8.3.2 -滤纸条须对称剪成32片并全部放人,加1.0mL 在25ml具塞比色管中加人滤纸条(5.8 柠檬酸盐缓冲液(5.7)浸润滤纸片,37C水浴平衡10 ,再依次加人2.00mL DNS试剂(5.9). min， 0.50mL酶液(8.3.1),5mL水,电磁振荡3s一5s,37C水浴中保温60min(用秒表控制),然后在沸水 浴中煮沸5min,冷却至室温,用水定容至25mL,在540nm波长处测定校准值A 在25ml具塞比色管中加人滤纸条(5.8 -滤纸条须对称剪成32片并全部放人,加1.0ml 柠檬酸盐缓冲液(5.7)浸润滤纸片,37C水浴平衡10min,再依次加人0.50mL酶液(8.3.1),5mL水 电磁振荡3s5s,37C水浴中保温60min(用秒表控制),加2.00mlDNS试剂(5.9),然后在沸水浴 中煮沸5min,冷却至室温,用水定容至25ml 在540nm波长处测定吸光度A1 结果计算 试样中滤纸纤维索酶活性以X表示,单位为酶活性单位每克(U/g),按式(I)计算 X= "x1000X" 式(1)中: -试样纤维素酶的活性,单位为酶活性单位每克(U/g) n 根据标准曲线方程上计算得的(Ai一A)值对应的彻萄糖的质量,单位为毫克(mg); M 葡萄糖的摩尔质量,180.2g/mol: -酶解反应时间,单位为分钟(min); 1000 mmol=l000 转化因子,I Mmol; 试样的总稀释倍数 9.2 每个试样取两份试料进行平行试验,测定结果用其算术平均值表示,保留3位有效数字 10 重复性 在重复性条件下的两次测定,所得结果的相对偏差不超过20%