国家标准 GB/35900.2一2018 动物流感检测第2部分:H3亚型流感病毒核酸荧光RT-PCR检测方法 Animalinfuenzadetection一Part2:Methodofreal-timeRI-PCRfor thedeteetionofH3 inflenzvirus 3subhype 2018-02-06发布 2018-09-01实施国家质量监督检验检疫总局发布国家标准化管理委员会国家标准
GB;/T35900.2一2018 前言 GB/T35900《动物流感检测》目前分为3个部分: -第1部分:Hl亚型流感病毒核酸荧光RT-PCR检测方法; -第2部分:H3亚型流感病毒核酸荧光RT-PCR检测方法; 第3部分:H和H3亚型流感病毒核酸双重荧光RT-PCR检测方法本部分为GB/T35900的第2部分本部分按照GB/T1.l一2009给出的规则起草本部分由农业部提出本部分由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口本部分起草单位.中华人民共相国北京出人境检验检疫局本部分主要起草人:刘环、乔彩霞、蒲静、张伟、高志强、谷强、张鹤晓、张利峰、韩晶
GB/T35900.2一2018 引言本文件的发布机构提请注意,声明符合本文件时,可能涉及到本文件4.1.8与“检测Hl和H3亚型流感病毒的核苷酸序列和试剂盒”相关的专利的使用本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场该专利持有人已向本文件的发布机构保证,他愿意向任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下，就专利授权许可进行谈判该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案相关信息可以通过以下联系方式获得专利持有人:北京出人境检验检疫局地址:北京市朝阳区甜水园街6号请注意除上述专利外,本文件的某些内容仍可能涉及专利本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任
GB;/T35900.2一2018 动物流感检测第2部分H3亚型流感病毒核酸荧光RT-PCR检测方法范围 GB/T35900的本部分规定了H3亚型流感病毒核酸的荧光RT-PCR操作方法本部分适用于禽、猪和马及其产品中H3亚型流感病毒核酸的检测规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19438.1一2004禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法 GB19489实验室生物安全通用要求缩略语下列缩略语适用于本文件荧光RT-PCR实时荧光反转录聚合酶链反应(real-imereversetranseriptpolymerasechainre- action C(或Cp)值每个反应管内的荧光信号量达到设定的值所经历的循环数(eyelethreshold,or crossingpoint 互补RNA(complementNA) cRNA DEPC 焦碳酸二乙惭(diethylpyrocarbonate FAM 梭基荧光素(carboxyluorescein) MGB 小沟结合物(mimorgroebinder 磷酸盐缓冲液(phosphatebuffersaline' PBS RNA 核糖核酸(ribonucleicacidD 试剂和材料 4.1试剂总则除非另有说明,所用试剂均为分析纯,所用液体试剂均需使用无RNA酶的容器进行分装 4.1.1 41.2TRIzol;2C25C保存 4.1.3氯仿:2C8C预冷 4.1.4异丙醇;-20预冷 4.1.5DEPC水:见附录A中A.1 4.1.675%乙醉;用新开启的无水乙醇和DEPC水配制,一20C预冷
GB/T35900.2一2018 4.1.7PBS(含牛血清白蛋白、青霉素和链霉素);配方见A.2 4.1.8引物和探针序列及反应液配方:见附录B 4.1.9阳性对照为灭活的H3亚型动物流感病毒或体外转录的H3亚型流感病毒HA基因cRNA溶液;阴性对照为已知流感病毒阴性的禽、猪或马组织悬液 4.2仪器设备及耗材 4.2.1荧光PCR检测仪及配套反应管(板) 4.2.2高速台式冷冻离心机(最高离心速度不低于120001 r/min 4.2.3台式离心机 4.2.4振荡器 4.2.5组织匀浆器 4.2.6冰箱(2C8C和-20C两种) 4.2.7微量移液器(54L、10AL、100AL、l000AL)及配套吸头(无核酸酶) 4.2.81.5ml离心管(无核酸酶)和5mmL采样管 5 实验室的标准化设置与生物安全管理本方法的实验室设置与管理见GB/T19438.12004附录C;实验室生物安全管理见GB19489. 样品的采集与前处理 6 6.1总则采样过程中样本不得交叉污染,采样及样品前处理过程中应戴一次性手套 6.2采样及处理工具 6.2.1采样专用商品化棉拭子,剪刀、银子,研钵、5ml采样管、一次性采样袋 6.2.2除棉拭子和采样袋外.上述取样工具应经121C士2C.15nmin高压灭菌并烘干或经160C干烤 2h 6.3样品采集 6.3.1拭子样品活动物采集拭子样品根据动物种类可采集咽喉拭子、泄殖腔拭子(禽类)或鼻拭子(猪、马等其他动物) 采集方法如下: -取咽喉拭子时将拭子深人喉头及上飘裂来回刮2次一3次并旋转,取分泌液 -取泄殖腔拭子时将拭子深人泄殖腔旋转一圈并沾取少量粪便; -取鼻拭子时将拭子深人鼻腔来回刮2次3次并旋转,取分泌物将采样后的拭子放人盛有2.0ml PBS(含牛血清白蛋白,青霉素和链霉素)的采样管中,编号 6.3.2组织样品病死动物采集肺脏或气管等组织用无菌剪、慑采集待检组织,装人一次性采样袋或其他灭菌容器,编号
GB;/T35900.2一2018 6.4样品贮运样品采集后置保温箱中,加人预冷的冰袋,密封,24h内送实验室 6.5样品处理 6.5.1拭子样品样品在振荡器上充分混合后,将拭子中的液体挤出,3000r/min离心5min,吸取上清液1.0m转人无菌的1.5mL离心管中,编号备用 6.5.2组织样品用无菌的剪刀和锻子剪取待检样品2.0g于研钵或组织匀浆器中充分研磨,再加l0.0ml PBs(含牛血清白蛋白、青霉素和链霉素)混匀,3000r/ /min m 离心5min后,取1.0ml.上清液转人无菌1.5 灭菌离心管中,编号备用 6.6样品存放采集或处理好的样品在2C8C条件下保存应不超过24h;若需长期保存,应放置一70C冰箱但应避免反复冻融(冻融不超过3次) 操作方法 7.1样品核酸提取 7.1.1在样本制备区进行,采取TRRIzol裂解法提取;也可采用其他等效的RNA提取方法 7.1.2待检样品、阳性对照和阴性对照的份数总和用表示,取n个灭菌1.5mL离心管,逐管编号 7.1.3每管加人600LTRlol. 7.1.4每管对应编号分别加人200L待检样品、阳性对照或阴性对照混匀 715 每管加人200L.氧仿,充分颠倒混匀于4、12000r/min离心15 min 7.18新取"个灭菌的1.5mL离心管,逐管编号.每管加人500L异丙醇(一20C预冷) 7.17吸取本标准7.1.5各管中的上清液500A.转移至7.1.5相应的管中,避免吸出中间层,艇倒混匀 7.1.8于4、12000r/min离心15 ,轻轻倒去上清,倒置于吸水纸上,沥干液体,不同样品应在吸 min，水纸不同地方沥干 7.1.9每管加人600L75%乙醇(一20C预冷),颠倒洗涤 7.1.10于4C、12000r/min离心l0min,轻轻倒去上清,倒置于吸水纸上,沥干液体,不同样品应在吸水纸不同地方沥干 7.1.114000r/ /min离心10s,将管壁上的残余液体甩到管底部,用微量移液器尽量将其吸干注意一份样本换用一个吸头,吸头不要碰到有沉淀一面 7.1.12室温干燥3min 不宜过于干燥,以免RNA不溶 7.1.13每管加人1lALDEPC水,轻轻混匀,溶解管壁上的RNA,2000r/min离心5s,获得RNA溶液,冰浴保存备用(4C保存不超过8h,若需长期保存应放置一70C冰箱) 7.2扩增试剂的准备与配制 7.2.1在反应混合物配制区进行
GB/T35900.2一2018 7.2.2每个检测反应体系需使用15AL荧光RT-PCR反应液根据7.1.2中设定的"值,按表B.2配制反应液,充分混匀后分装,每个反应管15AL 转移反应管至样本制备区 7.3加样 7.3.1在样本制备区进行 7.3.2在上述7.2.2的反应管中分别加人7.1.13中制备的RNA溶液10AL,使每管总体积达到25AL 记录反应管对应的样品编号盖紧管盖后,瞬时离心 7.4荧光RT-CR反应 7.4.1在检测区进行 7.4.2将7.3.2加样后的反应管放人荧光PCR检测仪内,记录反应管摆放顺序选定FAM作为报告基团,MGB作为淬灭基团,反应参数设置如下第一阶段,反转录42C/30 mIn; 第二阶段,预变性94C/3min; 第三阶段,94c/15s,50c/10s,60c/35s,40个循环,在第三阶段每次循环的60C退火延试验结束后,根据收集的荧光曲线和c(或Cp)值判定结果伸时收集荧光 8 结果判定结果分析条件设定 8.1 闯值设定原则;根据仪器噪声情况进行调整,以值线刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点为准 8.2实验成立的条件 8.2.1阴性对照无C(或C)值并且无扩增曲线 8.2.2阳性对照的C'(或Cp)值应<30,并出现典型扩增曲线(参见附录C) 8.2.3如阴性和阳性对照不满足以上条件,此次试验视为无效 8.3结果描述及判定 8.3.1阴性无C'或Cp)值并且无扩增曲线,表示样品中无H3亚型流感病毒核酸 8.3.2阳性 C(或Cp)值<30,且出现典型的扩增曲线,表示样品中存在H3亚型流感病毒核酸 8.3.3有效原则 C(或Cp)值>30,且出现典型的扩增曲线的样品建议复检复检仍出现上述结果的,判为阳性，否则判为阴性
GB;/T35900.2一2018 附录 A 规范性附录溶液配制 DEPC水配方 A.1 将DEPC加人去离子水(符合GB/T6682要求)中至终浓度为0.1%体积比),充分混合均匀后作用12h,分装,121C士2C高压灭菌30min,冷却后冷藏备用 A.2磷酸盐缓冲液(PBs)配方(含牛血清白蛋白、青霉素和链霉素) A.2.1A液 0.2mol几磷酸二氢钠水游液;NaHHPO.H.o27. g,溶于蒸憎水中,最后定容至1000 ml A.2.2B液 0.2mol/儿L 磷酸氢二钠水溶液;Na,HPO 7H,O53.6g或Na,HPO12H.,O71.6g或 Na.HPO2H.035.6g),加蒸馏水溶解,最后定容至1000mL A.2.30.01mol/L、pH7.2磷酸盐缓冲液(PBs)(含牛血清白蛋自、青霉素和链霉素)的配制取A液14ml,B液36mL,加NaC8.5g,牛血清白蛋白5g,用蒸僧水定容至1000ml 经过滤除菌后,无菌条件下分别按10000U/mL加人青霉索和链霉素
GB/T35900.2一2018 录附 B 规范性附录) 引物探针序列及荧光RT-PCR反应液配方引物探针序列 B.1 H3亚型流感病毒核酸荧光RT-PCR检测方法所用的引物探针序列见表B1 表B.1引物探针序列检测靶基因引物或探针名称序列(5'-3' 基因组位置上游引物 TGGATTTCMTTYGCCATATCAT 1597nt1618nt 下游引物 (GCAAATGTrGCAYcTRATRTTG H3亚型流感病毒HA基因 1674ntl695nt FAM-TGGCARGcCcAcCAT-MGB 探针 1654nt一1667nt 注1上游和下游引物均为简并引物,探针为MGB修饰的短探针注2:引物和探针可由生物公司合成,纯度为HPLC级,用DEPC水溶解并稀释至终浓度10Amol/L，,-20C保存备用注3:引物探针是根据已发布的毒株序列进行设计,基因组位置参考毒株A/Swine/Minnesota/593/99H3N2) HA序列(GenBank登录号:AF251427.2) B.2荧光RT-CR反应液配方 H3亚型流感病毒核酸荧光RT-PCR反应液配方见表B.2 表B.2荧光RT-PCR反应液配方组分 1个检测体系的加人量 5×RT缓冲液 5,0AL MgCl.(25mmol/L) 1.0L dNTP(2.5mmol/1) 2.04L 4mol/1 上游引物(1o l1.0 下游引物0molL l.04l. 探针(10Amol/L 0.5AL M-MLV反转录酶(200U/L 0.5L 0.25 RNA酶抑制剂(40U/Al l AL Ta酶'(5U/L 0.25AL DEPC水 3,5L 5×RT缓冲液的组成为:375mmol/IKCI、15mmol/IMgCl、50mmol/IDTT、250mmol/LTris-HClpH 8.3,25C) Taq酶;具有5'--3'外切活性
GB;/T35900.2一2018 B.3注意事项在检测过程中,应严防不同样品间的交叉污染反应液分装时应避免产生气泡,上机前检查各反应管是否盖紧,以免荧光物质泄露污染仪器
GB/T35900.2一2018 附录 C 资料性附录) 典型扩增曲线示意图 H3亚型流感病毒核酸荧光RT-PCR检测方法阳性和阴性典型扩增曲线见图C.1 18.986- 17.486 15.986- 阳性 14.486 12.986 11.486 9.986 8.486 6.986 5.486 3.986 2.486- 0.986 -阴性 20 25 30 35 扩增循环数图C,1H3亚型流感病毒核酸荧光RT-PCR典型扩增曲线示意图

动物流感检测第2部分：H3亚型流感病毒核酸荧光RT-PCR检测方法GB/T35900.2-2018

动物流感是一种严重的传染病，可以对动物健康和人类健康造成威胁。因此，针对动物流感的检测方法十分重要。H3亚型流感病毒是近年来逐渐普及的一种病原体，在动物流感检测中也备受关注。GB/T35900.2-2018标准中介绍了一种针对H3亚型流感病毒的核酸荧光RT-PCR检测方法。

什么是核酸荧光RT-PCR检测方法？

核酸荧光RT-PCR是一种高灵敏度、高特异性的核酸分子检测技术。其中，RT是反转录(Reverse Transcription)的缩写，PCR是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)的缩写。这种技术可以将RNA转录成为cDNA，并且进行扩增，同时利用荧光探针来检测样本中是否存在目标序列。

核酸荧光RT-PCR检测方法在动物流感检测中的应用

GB/T35900.2-2018标准中介绍了一种针对H3亚型流感病毒的核酸荧光RT-PCR检测方法。该方法利用引物和探针的特异性结合，可以快速、准确地检测出样本中是否存在H3亚型流感病毒，具有非常高的敏感性和特异性。

不仅如此，该方法还可以通过优化反应体系，提高检测灵敏度和稳定性，同时也可以应用于多重病原体检测。因此，该方法已成为目前动物流感检测领域的主流技术之一。

结论

动物流感的防控尤为重要，其中检测方法的选择是关键因素之一。H3亚型流感病毒核酸荧光RT-PCR检测方法具有快速、准确、高敏感性、高特异性和多重病原体检测等优点，已成为目前动物流感检测领域的主流技术之一。随着科技的不断进步，相信这一检测技术也会不断完善，为动物流感的防控提供更加有力的保障。