GB/T28982-2012
番茄斑萎病毒PCR检测方法
DetectionofTomatospottedwiltvirusbyPCR
- 中国标准分类号（CCS）B16
- 国际标准分类号（ICS）65.020.01
- 实施日期2013-06-01
- 文件格式PDF
- 文本页数15页
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番茄斑萎病毒PCR检测方法
国家标准 GB/T28982一2012 番茄斑萎病毒PCR检测方法 DeteetionoftomatospottedwiltvirusbyPCR 2012-12-31发布 2013-06-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T28982一2012 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口
本标准起草单位;上海出人境检验检疫局、厦门出人境检验检疫 局、北京出人境检验检疫局
本标准主要起草人;于翠,杨翠云、廖富荣,易建平,邓丛良、戚龙君
GB/I28982一2012 番茄斑萎病毒PCR检测方法 范围 本标准规定了番茄斑萎病毒的RT-PCR,免疫磁珠RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测方法
本标准适用于包括种子苗木和无性繁殖材料的活体植物材料及传毒介体中携带的番茄斑萎病毒 的检测
规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
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s/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样 番茄斑萎病毒基本信息 中文名;番茄斑萎病毒 英文名;tomatospottedwiltvirus 缩写;TswV 分类地位;布尼亚病毒科(Bunyaviridae),番茄斑萎病毒属(Tosboirus) 番茄斑萎病毒其他信息参见附录A
方法原理 用特异性抗体修饰的磁株吸附待测样品中的病毒粒子后经高温裂解释放出病毒RNA,或直接从待 测样品材料中提取植物总RNA,然后在逆转录酶的作用下合成eDNA,以eDNA为模板再通过普通 RT-PCR或实时荧光RT-PCR进行检测
分析PCR结果即可明确材料中是否含有病毒核酸成分
仪器用具及试剂 5.1仪器设备 PCR仪,实时荧光PCR仪,旋转孵育器,电泳仪,凝胶分析成像系统,水浴锅,高速冷冻离心机,高 压灭菌锅,微波炉,涡旋振荡器,电子天平(感量0.001g),超低温冰箱(一80C)等
5.2用具 磁力架,可调式微量移液器,无RNase吸头,无RNase离心管，PCR管,研钵等 5.3试剂 除有特殊说明外,所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂
试剂配制见附录B
番茄斑萎病毒抗体,磁珠(具有超顺磁性的聚苯乙烯珠子,直径280nm,表面标记有甲苯磺酰基).
GB/T28982一2012 Trizol或RNA抽提试剂盒,三氯甲炕,异丙醇,无水乙醇,无RNAase水,逆转录试剂盒,PCR反应相关 试剂,澳化乙锭,DNA相对分子质量标记(100bp~2000bp),琼脂糖等
抽样和样品制备 6.1症状观察 现场检疫主要观察进境植物材料上病毒为害的症状,TSwV为害症状描述参见附录A 抽样 尽量抽取有病毒为害症状的植物材料送检,当寄主植物无症状时,也需要抽样送检
若在抽样过程 中发现蓟马,则需高度重视植物样品和发现的所有蓟马装人虫样管中送实验室检测
抽样方法按 SN/T2122中规定执行
6.3样品制备 如果是种苗样品,建议在植物的不同部位采样、制样以避免病毒在植物体内分布的不均匀;将待谢 样品放人研钵后加人液氮研磨,取100mg用于抽提RNA;或者将待测样品在常温下研磨后加人样品 抽提缓冲液,离心取上清液用于免疫磁珠分离
检测鉴定 采用RT-PCR(见附录C)、免疫磁珠RT-PCR(见附录D)和实时荻光RT-PCR(见附录E)进行病毒 检测,鉴定
结果判定 8 8.1样品经RT-PCR,免疫磁珠RT-PCR和实时荧光RT-PCR三种方法之一检测为阴性时,判定样品 不携带番茄斑萎病毒
8.2样品经RT-PCR和免疫磁珠RT-PCR检测为阳性,需要进行序列测定,如果序列测定结果证实与 所检测的番茄斑萎病毒一致,则可判定携带番茄斑萎病毒
8.3样品经实时荧光RT-PCR检测为阳性时,也可判定样品携带番茄斑萎病毒
样品保存和结果记录 9.1样品保存 经检测确定携带番茄斑萎病毒的样品应保存在适合的条件下以备复核
如种子在干燥条件下保存 6个月,其他繁殖材料在一20C保存,带毒介体则保存于一80C
做好登记和标记工作
9.2结果记录 记录包括:样品来源、种类、取样人员、实验的时间、地点、方法和结果、检验检疫员的签字等
RT-PCR检测或免疫磁珠RT-PCR应有电泳结果照片及序列测定报告,实时荧光RT-PCR应有扩增曲 线图片等
GB/T28982?2012 ?A ?? ?? A.1? A.1.1? ???Χ?,?70925???:(Lycopersicon esculentumCa Lactucasatia?(Pisumsatizum ?(Nicotiana apsicum.annuum),?(Ld labacumm)Solanumtuuberosum)(Ananascomosus)仨(Arachish3 hypogaea anazaliagladiata),(Crotalariajuncea. ,(Gl/yeinemd.r)?(Helianthsanuus Nicandlra ysaloides?Phaseolus Mhy uwlguris(PMhysaliperuoiana ongena?(Tephrosiaururea)?(Viciafabua?(Vigna ? .Solanummelon VignaradialaWgnaumguiculala?Zinniaelegans) Asroemeria aurantiaca(Anemonecathayensis),(Aiumgraeolens)?(Begoniaeansiana Benincasahisbida?Caricaaaya)Cichoriumintybus)??.CiceT urieium,(Crulluslanaus)(Callisehuschinensis)(Catharunhusrosews ?(Cucumissativus)?(Cucurbitaepo(Cyphomandrabetacea,?(Cynara scolymus),(Dahliapinnata),??(Eustomarusellianum (Ficuselastica ?(Ficuspumila),?(Gerberajamesoni),?(Galinsogaarui/lora,(Gossybium Linn.?(ImatiensLinn.?(Lathyrussativus)?(Lupinsolyphylus (Menthapiperila,(Omcidium)(PhalaenopsiBlume)?Seehium edule)?(SininEidsprciosa)(Vidiinifera(Zantedexchia aelhiopic ?(Pet 'elwniaJuss.,?(Dendranthemamorifoliwm,?(Pelargoniwmhororwm, (Ocimumba.silicum ? A.1.2? maranthu4s ???????м,?;?(An sspinosus (Sellariamedia?(Cheobodiumalbum)?(Arcetiumlaa)?(Bidensbilosa ?(Galino3 ),(Capelabwrasri)?? sogaurdMwra),?(Swnhusdleru 1ceS Melilt llusoficinalis)СMalcaaro/lora?Limoniulatioliunm)? PorlulacdoleraceaeSolanumnigrum)Trobaeolummajus)?(Verbena ) itoralis" A.1.3??? ,???/? A.1.4Σ?? TswVΣ??,????,???,,????? ?,ò?Щ?????? ???;????????,?,????? ??,??С???????????
GB/T28982一2012 死严重时,能够导致植株死亡
偶尔症候仅在水果上发现
辣椒上的症状;植株矮化和黄化,叶片出现褪绿线纹或花叶并伴有坏死斑,茎上坏死条纹从茎 部蔓延至枝端
成熟果实产生黄化,伴有同心环或坏死条纹 莴苣上的症状;植株受害后,从一侧叶子开始出现褪绿并产生褐色斑块,接着中央叶片开始褪 色,之后这一侧植株停止生长产生特征性的变形
花生上的症状:表现为芽坏死,叶片褪绿和植株死亡 猫化上的症状:不同品种症状差异较大,常见的症状有茎黑色条纹和麦鹉.Goxina品种的菊 花被害症状是产生黄色或褐色叶斑或叶片转为栎叶状
凤仙花上的症状:一些受INSV和TSWV感染的新几内亚杂种的栽培品种出现矮化,叶基变 黑或叶片出现褐色叶斑
大岩桐上的症状;染病叶片显示让黄色或褐色叶片斑驳或者褐色橡树叶片图案
A.1.5传毒方式 自然界至少有九种蓟马可以持久性传播该病毒,分别为8种蓟马科(Frunkliniellaoccidentalis. F ,F
,Sci schullsei,F lenuicornis,Thripstaaci,T
seosus,T
mouloni ddorsals) 、/usca, rtolhrisdl 和1种管蓟马科(Lithrisdorsalis)昆虫介体
蓟马若虫获毒,成虫不能获毒,但只有成虫才能传毒,介 体有的可以终生带毒
千里光属植物和番茄种子可以带毒,但仅发现1%是感染性的,病毒带在外种皮 上而不在胚内
可摩擦接种
A.2分布 欧洲;比利时、保加利亚,克罗地亚,捷克、丹麦,芬兰,法国、德国、希腊、克里特岛、匈牙利爱尔兰、 意大利、立陶宛、马耳他、摩尔达维亚、荷兰、挪威、波兰、葡萄牙、罗马尼亚、俄罗斯远东及南部、 斯洛伐克、西班牙,加纳利群岛、瑞典,瑞士,英国,南斯拉夫
亚洲;阿富汗,亚美尼亚、阿塞拜疆、四川、云南和广东,台湾、塞浦路斯、印度、以色列、 日本北海道、日本本州、琉球岛群岛、马来西亚、尼泊尔、巴基斯坦、沙特阿拉伯、斯里兰卡、泰国、 土耳其,乌兹别克斯坦
非洲;阿尔及利亚、刚果民主共和国、埃及、利比亚、马达加斯加、毛里求斯、摩洛哥、尼日尔 尼日利亚,塞内加尔,南非、,苏丹、,坦桑尼亚、突尼斯、乌干达,津巴布韦
南美洲:阿根廷,波利维亚、巴西、智利、丰亚那海地、牙买加、马提尼克、巴拉洼波多黎各、乌拉洼、 委内瑞拉
北美洲;加拿大、墨西哥、美国
大洋洲;澳大利亚,新西兰,巴布亚新儿内亚
A.3粒体形态 病毒粒子为球形,直径约为85nm,表面有一层膜包裹,膜外层由5nm厚几乎连续的凸起层组成 基因组 三分体基因组,其中ssRNA-I为负义,ssRNA-M和ssRNA-s为双义,各个基因组片段具有末端 序列,在3'端是UcUcGUU..,在5'端是AGAGCAAU...,区域互补而形成锅饼状结构
番茄斑萎 病毒的1片段编码一个332kDa的多聚酶;M片段的互补链RNA编码两个糖蛋白G1和G2,病毒链 RNA编码33.6kDa非结构蛋白NSm;s片段的互补链RNA编码28.8kDa外壳蛋白,病毒链RNA编 码52.4kDa非结构蛋白NSs
GB/T28982?2012 ? B 淶?? ? B.1???(pH7.4 (NasO. .3g 1. ???(PVP,Mw240004000020g (NaN,) 0.2g Tween-20 20mL 900mL1PBST,HCIpH7.4,1000 ml B.2??建?(pHH7.4) 800mL 1XPBST? ???(BSA 2g PVP(MW2400040000 20g g ?и?1000mL B.3??TAE(50x) ??(Tris) 242g 52.1ml ?(EDTA0.5mol/L) 100mmL ????1TAE B.4??(EB)?(10g/L ?? 20mg ?? 0ml. B.5?A0.1mol/L??pH7.4 2 82g (NaH_PO. (NaHPO 14.42g ???,1000mL B.6?B(0.1mol/L??pH19.5 (HBO 6.183 g ?800mL??,5mol/L.NaOHpH9.51000mL
GB/T28982?2012 B.7?c[λ?(0.1%SAp7.4] 0.88g (NaCD 0.I ???(EBSA ?80mL0.01mol/??pH7.4,??100 ml B.8?[0.2mol/LIrisp8.5with0.1%?BSA] 2.42gTris80ml??,1mol/IHClpH?8.5?0.1%BSA 100ml
GB/T28982一2012 附 录c 规范性附录 RT-PCR方法 C.1引物 TswVCPF;5'-GcTTTGTTGACACAAGGCAAAGAcC-3” TswVCPR:5'-GGCAAGCCTCACAGACTTTGCATC-3’ 扩增片段长度为390bp C.2植物总NA的提取 C.2.1取1g样品,放人研钵后加人液氮研磨至细粉,然后取0.1g放人灭菌离心管中,加人1mL Trizol,混匀
C.2.2加人0.2mL三氧甲婉,猛烈振荡15s,4C11000离心10min,小心吸取上层无色水相到新 离心管中 C.2.3加人等体积异丙醇,混匀,-20C静置10min,4C12000g离心15min,保留沉淀
C.2.4加人1ml.75%预冷乙醇,悬浮沉淀,4C8000离心10min,干燥沉淀
C.2.5加人30AlLDEPC-H.O,溶解沉淀(必要时,55C~60C水浴10min,加速溶解)
若不能立即 使用建议保存于-80C冰箱备用
注;或者按照商品RNA提取试剂盒进行操作
C.3cDNA第一链的合成 反应体系20AL,其中2l
模板RNA,1AL
反向引物(20mol/L),4l5×AMV酶缓冲液， 2ALdNTP(10mmol/L),l!LAMV反转录酶(5U/aL),1AlLRNAase抑制剂,9L无RNAase的 水
42C反应1h
C.4CR反应 PCR反应体系见表C.1,每个样品设2个平行处理
反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不 同的反应总体积进行适当调整
检测时以含番茄斑萎病毒材料的cDNA或含有番茄斑萎病毒目标片 断的质粒作为阳性对照,以健康植物材料作为阴性对照,以水代替模板作为空白对照
反应条件;94C 4min a;94C30s,5830s、72C45s,.30个循环;72C10min延伸
取10ML扩增产物与2ML的 6×上样缓冲液混合均匀,在0.5×TAE缓冲液配制的l.5%琼脂糖凝胶中,4V/cm6V/cm电泳 30min ,澳化乙锭(EB)染色后在成像系统中观察,拍照并保存
GB/T28982一2012 表C. RT-PCR反应体系 加样量 终浓度 名称 储存液浓度 Al R缓冲液 l0× 2.5 dNTP 2.5mmol/1 200Mmol/L 5 上游引物 0.2mol/L 0 10mol/L 104mol/L 0.24mol/I 0.5 下游引物 Ta傅 5U/L 0.05U/L 0.25 cDNA 1.5 无菌水 17.75 总体积 25 C.5结果判定 C.5.1阳性对照在390bp处有扩增片段,阴性对照和空白对照无特异性扩增,待测样品在390bp处 无条带,则可判定样品为番茄斑萎病毒阴性
C.5.2阳性对照在390p处有扩增片段,阴性对照和空白对照无特异性扩增,待测样品出现与阳性对 照一致的扩增条带,可通过测序的方式进一步确认
如果PCR产物序列与番茄斑萎病毒的序列同源， 则可判定样品为番茄斑萎病毒阳性,若序列不同源,则可判定样品为番茄斑萎病毒阴性
GB/T28982一2012 附 录D 规范性附录 免疫磁珠RT-PCR方法 D.1免疫磁珠分离 D.1.1磁珠的清洗 D.1.1.1将装有纳米磁珠的瓶子,涡旋混匀1min,过程中避免出现泡沫 D.1.1.2根据待检测的样品数量移取适量的磁珠,加人离心管中
D.1.1.3将离心管放人磁力架上约2 min， 1,直到磁珠贴壁,液体部分澄清透明
D.1.1.4将清液移出,操作过程避免影响到贴壁的磁珠
D.1.1.5将磁珠重新悬浮于缓冲液B中 D.1.1.6重复D.1.1.3~D.1.1.5步骤,将磁珠清洗3~5次,以备后用
D.1.2抗体的包被 D.1.2.1计算抗体和磁珠使用浓度,推荐按照3g抗体/10”磁珠的浓度进行包被,但此浓度仅为推 荐浓度,不同来源的抗体包被浓度可能不同
D.1.2.2向含有适量清洗后的磁珠的离心管中加人100L约34g的抗体,用枪头轻轻吹打,使之成 为均一的悬浊液
D.1.2.3将此悬浊液置37C过夜(16h~18h),过程中始终保持离心管的旋转振荡,避免磁珠沉淀到 管底,影响包被效果
D.1.2.4将试管放于试管架上2min,待磁珠贴壁,液体部分澄清透明,去除清液
D.1.2.5将包被有抗体的磁珠按以下步骤清洗 -加人缓冲液c置4C清洗5nmin,2次; -加人缓冲液D置37笔清洗4h; -加人缓冲液C置4C清洗5min D.1.2.6已经包被抗体的磁珠可以直接用于抗原吸附
若暂时不用,也可保存于缓冲液c中,在4" 的温度条件下可保存数月,为避免滋生细菌,可加0.02%的叠氮钠
注;该体系可根据需要自行调整
D.1.3抗原吸附 D.1.3.1将样品或阴性对照和阳性对照用病毒提取缓冲液稀释备用
D.1.3.2取病汁液加人到包被有抗体的磁珠中,用枪头轻轻吹打1nmin,混合均匀 D.1.3.3将此悬浊液置37C孵育器中2h,过程中始终保持离心管的旋转振荡,避免磁珠沉淀到管 底,影响吸附效果
D.1.3.4将包被好抗原的磁珠放于磁力架上吸附2nmin左有,待磁珠贴壁,液体部分澄清透明,去除 清液,备用
D.1.3.5将吸附好抗原的磁珠用无RNase的水漂洗.500030s离心沉淀磁珠
GB/T28982一2012 D.2eDNA第一链的合成 直接在吸附了病毒的带有磁珠的离心管中进行反转录
反转录体系总体积为20L,其中1L
反 向引物(20mol/L),4L5×AMV酶缓冲液,2AldNTP(10mmol/L),llAL无RNAse的水,稍离心 混匀后置于85C孵育器中变性5min,迅速置冰上2min3min 1,然后迅速加人1LAMV反转录酶 (5U/L),lALRNA酶抑制剂(40U/L),42C反应1h D.3PCR反应 具体步骤见C.4 D.4结果判定 阳性对照在30bp处有扩增片段.,阴性对照和空白对照无特异性扩增,待测样品在390p处 D.4.1 无条带,则可判定样品为番茄斑萎病毒阴性
阳性对照在390p处有扩增片段,阴性对照和空白对照无特异性扩增,待测样品出现与阳性对 D.4.2 照一致的扩增条带,可通过测序的方式进一步确认
如果RCR产物序列与番茄斑羞病毒的序列同源 则可判定样品为番茄斑萎病毒阳性,若序列不同源,则可判定样品为番茄斑萎病毒阴性
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GB/T28982一2012 附 录 E 规范性附录 实时荧光RT-PCR方法 E.1引物(引自Boonhametal.,2002) E.1.1IswV检测引物和探针 TSwV-CP-17F;5'-TSwVCTcTTGATGATGCAAAGTCTGTGA-3’ TswV-CP-100R:5'-TSwVTcTCAAAGCTATCAAcTGAAGCAATAA-3” TSwV-CP-73T:5'-AGGTAAGC'TACCTcCCAGCATTATGGCAAG-3’ E.1.2蓟马内源基因引物和探针 wFT-RRNA-25FwFT-aetin5'-GGTATCGTCCTGGACTcCTGGTG3’ wFT-RNA-93RwFT-actin5'*-GGGAAGGGCGTAAcCTTcA-3 wF:T-RNA-48TwFT-actin5'-CGGTGTcTccCACACTGTcCcCA-3 E.2RRNA提取 E.2.1植物RNA提取 见附录C.2. E.2.2蓟马RNA提取 将单个昆虫放人0.5mL离心管中,加人50.DEPC处理水(在冰上操作)浸软
每个样品中加 )A50%(质量浓度)的chdex" 人50" resin(ChelexI00，Biorad)
94C加热5min
4C13000！离心 5 min
弃沉淀,上清液一20C保存
E.3eDNA第一链的合成 见附录c.3
E.4实时荧光RT-PCR反应 PCR反应体系见表E.1,每个样品设2个平行处理
反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不 同的反应总体积进行适当调整
检测时以含番茄斑萎病毒材料的cDNA或含有番茄斑萎病毒目标片 断的质粒作为阳性对照,以健康植物材料作为阴性对照,以水代替模板作为空白对照
反应参数;95C 预变性10min;95C15s,60C1min,40个循环 11
GB/T28982一2012 表E.1实时荧光PCR反应体系 加样量 试剂 终浓度 贮备液浓度 Al l0× PCR缓冲液 2.5 3.0mmol/ 25mmol/1 MgC dNTP 5 10mmol/I 0.2mmol/I 0 TSWwV-CP17F 204mol/L 0.154mol/L 0.3 TSWV-CP-100R 20amol/L 0,15mol/1 0,2 20Mmol/L 0.154mol/I WFT-RNA-25F 0,2 wFT-RNA-93R 20amol/L 0.154mol/I 0.2" TSWV-CP-73T(FAM标记 20mol/1 0.154mol/I wFT-RNA-48T(VIC标记 204mol/L 0.154mol/L 5U/l Taq酶 0.04 U 0.2 cDA 补水至 25 E.5结果判定 E.5.1闵值设定;闵值设定根据仪器噪音情况进行调整,或以阂值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲 线的最高点,结果显示阴性为准
E.5.2待测样品的Ct值为40或无Ct值时,则判定未检测到番茄斑萎病毒
E.5.3待测样品的C值小于或等于35时,则判定检测到番茄斑萎病毒
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GB/T28982?2012 ame,J.,MorisJ.Spence,N.Bennison,J. [1]Boonham N.,SmithP.,walshK.Tan BarkerI.2002.ThedeteetionofTomatospottedwiltvirusTSwVinindividualthripsusingreal timeluorescent tRT-PCR(TaqMan),JournalofVirologiealMethods101:37-48. 13
番茄斑萎病毒PCR检测方法GB/T28982-2012
引言：
番茄斑萎病毒是一种严重危害番茄生产的病毒，其感染后会导致植株枯萎、叶片变黄等症状，严重影响果实产量和品质。因此，及早、准确地检测番茄斑萎病毒显得非常重要。
PCR检测方法：
PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种利用DNA聚合酶扩增特定DNA序列的技术。在番茄斑萎病毒的PCR检测中，可采用以下步骤：
- 提取番茄植株中的叶片总RNA，并将其转录成cDNA模板；
- 设计适合目标基因的引物，并进行PCR扩增；
- 将PCR产物进行凝胶电泳分析，若出现目标片段，则说明样品中存在番茄斑萎病毒。
GB/T28982-2012标准：
GB/T28982-2012是一项关于番茄斑萎病毒检测的技术规范，主要对PCR检测方法的操作流程、引物设计、反应条件等方面进行了详细规定。
优点与局限：
PCR检测方法具有检测灵敏度高、特异性强、操作简便等优点。但是，该方法也存在一定的局限性，比如可能受到样品中的抑制物影响，造成假阴性结果等。
结论：
基于PCR技术的番茄斑萎病毒检测方法可以准确、快速地鉴定样品中是否存在该病毒，能够有效预防和控制该病害的发生。而符合GB/T28982-2012标准的操作流程和实验条件则保证了检测结果的可靠性和准确性。
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