溶菌酶活性检测方法

溶菌酶活性检测方法

国家标准 GB/T30990一2014 溶菌酶活性检测方法 Determinationoftheactivityoflysozyme 2014-07-24发布 2015-03-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T30990一2014 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC387)提出并归口 本标准起草单位深圳市计量质量检测研究院、测试技术研究院、珠海出人境检验检疫局 本标准主要起草人:赖晓芳、谭和平、林霖、孙登峰、赖心田、兰全学、杨国武、李意、李浙、潘兰芳、 杨泽、莫秋华
GB/T30990一2014 溶菌酶活性检测方法 范围 本标准规定了溶菌酶活性检测方法 本标准适用于生化试剂、不同工业产品及其原料中溶菌酶活性的测定 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 溶菌酶lysyme -种葡萄糖苷酶,通过其肽链中的Glu35和Asp52残基构成的活性部位催化水解细菌细胞壁中的 N -乙酰胞壁酸的C1与N-乙酰氨基糖的C4之间的糖苷键,从而迅速溶解细菌细胞壁中的多糖 成分 注:又名球蛋白G胞壁质酶、N-乙酰胞壁质聚糖水解酶 3.2 溶菌酶活性lysozymeaetiits mol/L磷酸盐缓冲液(pHH6.2)中,以溶壁微球菌为底物,于450n处每分钟使吸光 在25C,0.l 活性单位为U/mg或U/g或U/mL 度值下降0.001时所需的酶量， 原理 本检测方法以溶壁微球菌(Mrwccu、ywdeikticws)为反应底物,使用溶菌酶催化水解其细胞 壁,细菌因失去细胞壁的保护无法维持细胞内渗透压平衡而裂解死亡,导致菌悬液的浊度降低,通过紫 外一可见分光光度计测定在450nm处的吸光光度值的变化并换算出样品酶活性单位 仪器设备及器具 5.1生物安全柜 5.2灭菌锅 5.3摇床:(37士1 5.4恒温培养箱:(37士1C 5.5离心机可达12000g/min.
GB/T30990一2014 5.6pH计;精确至0.01pH 5.7电子天平:分度为0.001g 5.8恒温水浴锅:(25士1 5.9紫外-可见分光光度计:吸光度值精确至0.001 5.10石英比色皿:1cm 5.11微量移液器:100L~1000L 试剂 6.1总则 除非另有规定,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6882规定的三级水 6.2磷酸盐缓冲液(pH6.2 二水合磷酸二氢钠11.71g,十二水合磷酸氢二钠7.85g,定容至1L 6.30.1mol/L氢氧化钠 称0.生g氢氧化钠充分溶解于50mL去离子水,定容至100mL,高压蒸汽灭菌(121C,20min). C保存备用,用时恢复至室温 6.4液体LB培养基 胰蛋白陈10g,醉母提取物5g,氧化钠10g,加适量去离子水充分溶解,采用0.1mol/几氢氧化纳 6.3)调节pH至7.4,并定容至1L 高压蒸汽灭菌(121c,20min) 4七保存备用,用时恢复至室温 6.5LB琼脂斜面 肤蛋白陈10g,酵母提取物5g.叙化钠10g,琼脂粉20g,加适量去离子水充分溶解,采用 0.1mol/1氢氧化钠(6.3)调节pH至7.4,并定容至1L 高压蒸汽灭菌(121,20min) 采用无菌试 管,分装制成琼脂斜面,4C保存备用,用时恢复至室温 6.6LB琼脂平板 胰蛋白陈10g,酵母提取物5g,氧化钠10g,琼脂粉20g,加适量去离子水充分溶解,采用 a.1mol/几氢氧化纳(6.3)调节pH至7.4,并定容至1I. 高压蒸汽灭菌(121C,20min) 采用无菌平 皿,分装制成琼脂平板,4C保存备用,用时恢复至室温 分析步骤 7.1反应底物制备 注:若市售溶壁微球菌冻干粉经验证与经上述制备的反应底物等效,则可直接使用 7.1.1菌株复苏 以无菌操作方式,取0.5mL液体LB培养基(6.4),滴人装有溶壁微球菌标准菌株(crocd y 0cc.s sodeiktic4、F/eming,CGMCC1.634)冻干粉的安瓶瓶中,轻轻振荡,使冻干菌体溶解呈悬浮状 将菌体 悬浮液移植人LB琼脂斜面6.5),37C培养箱,培养18h~24h 4C保存备用
GB/T30990一2014 7.1.2菌株扩大培养 以无菌操作方式,挑取适量菌体至LB琼脂平板(6.6)中划线纯化,在(37士1)C培养箱中培养24h. 并观察单菌落形态 选取湿润,凸起,边缘光滑,呈黄色的菌落,于LB琼脂平板(6.6)中再次划线纯化 在(37士1)C培养箱中培养24h 平板于4C保存，一个月内使用 挑取二次划线纯化的LB琼脂平板6.6)中的单菌落于50mL液体LB培养基(6.4)中混匀,于 37士1)笔恒温摇床中,l10r/min摇菌18h后于4保存,用时恢复至室温，一周内使用 取500AL菌液至50mL液体LB培养基(6.4)中混匀,于(37士1C恒温摇床中,1l0r/min摇菌 18h后用于制备菌悬液 7.1.3菌悬液制备 将菌液(7.1.2)离心(12000g,5min)收集菌体,采用磷酸盐缓冲液(6.2)洗涤菌体至无培养基 状态 开机(5.),调波长至450nm,于(25土1)C室温预热,将一定量菌体悬浮于按62配制的瞬殿盐级 冲液中,调节菌体浓度,使450nm处吸光度值为1.300 7.2测定 7.2.1试样制备 7.2.1.1前处理 工业产品及其原料应充分溶解,除去不溶物后再进行量取;鸡蛋样品应采用蛋清分离器取其蛋清后 再进行称重 7.2.1.2生化试剂 准确称取1mg(精确至0.001g)固体酶粉或量取lmL精确至0.01mL)液体酶液,于适量磷酸盐 缓冲液中,用磷酸盐缓冲液(6.2)稀释,使其1min内吸光度值变化量处于0.025一0.125,且1min时读 值不应小于1.000 同一试样进行平行试验测定 7.2.1.3工业产品及原料 准确称取1g(精确至0.01g)样品,于适量磷酸盐缓冲液(6.2)使其充分溶解并定容至100mL,使 其1min内吸光度值变化量处于0.025一0.125,且1nmin时读值不应小于1.000 同一试样进行平行试 验测定 7.2.2检测 于(25士1)C的室温或恒温水浴锅中,于反应管中加人2.5mL菌悬液(7.1.3),加人0.5mL酶液 反应1min时记录450nm处的读数A1,反应2min时记录450nm处的读数Aa 通过公式换算得出 对应的酶活性 每个样品做两个平行 8 结果 8.1 结果计算 用式(1)计算酶活性:
GB/T30990一2014 |Ai一A 0.001又EW 式中 酶活性; IAi一Al 450nm处每分钟吸光度的变化 -0.5mL检测用酶液中含有原始酶液的质量(mg或g)或体积(ml); Ew -以每分钟使450nm处吸光度值下降0.001为一个活性单位 0.001 注;生化试剂中,固体样品活性单位为U/mg,液体样品活性单位为U/mL;工业产品及原料活性单位为U/g 8.2质量控制 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算数平均值的10%

溶菌酶活性检测方法GB/T30990-2014

溶菌酶是一种能够裂解细菌细胞壁的酶，广泛存在于动植物及微生物中。由于其具有良好的抗菌作用，因此在医药、食品等领域得到广泛应用。为了保证溶菌酶制品的质量，需要对其活性进行检测。GB/T30990-2014就是针对溶菌酶活性检测制定的标准。下面我们来详细介绍一下该标准的实验步骤。

一、试剂准备

1.1 氯化钠溶液（0.9%）：称取氯化钠9g，加入蒸馏水1000ml中，混合均匀即可。

1.2 磷酸盐缓冲液（PBS）：称取NaH2PO4·2H2O 0.01mol/L 1.44g、Na2HPO4·12H2O 0.01mol/L 5.10g，加入蒸馏水1000ml 中，调节pH至7.2-7.4。

1.3 溶菌酶：根据产品说明配置溶菌酶溶液。

1.4 肉汤培养基：称取肉汤粉6g，加入蒸馏水1000ml中，混合均匀后煮沸至完全溶解，冷却后灭菌（121℃，15min）即可。

1.5 葡萄糖酸钠盐（GSA）：称取葡萄糖酸钠盐0.05mol/L 5g，加入蒸馏水1000ml 中，混合均匀后灭菌（121℃，15min）即可。

二、实验步骤

2.1 准备细菌悬液。从肉汤培养基上选取一株待测细菌，接种到含有肉汤培养基的试管中，培养至对数生长期，用PBS洗涤3次，以去除培养基中的干扰物。

2.2 用PBS稀释细菌悬液。将洗涤后的细菌悬液稀释至10^7CFU/mL。

2.3 加入溶菌酶。将100μL稀释好的细菌悬液加入含有10μL不同浓度溶菌酶的离心管中，同时加入90μL GSA缓冲液，混合均匀，放置于37℃恒温摇床上反应30min。

2.4 稀释样品。将反应后的样品依次稀释10倍，共稀释5次，每次取100μL样品加入96孔板中。

2.5 添加底物。将100μL含有1mg/mL透明质酸钠（HA）的PBS溶液加入96孔板中，混合均匀后，放置于37℃恒温摇床上反应30min。

2.6 加入酸性硫酸。将100μL 0.1mol/L酸性硫酸加入96孔板中，停止反应。

2.7 测量吸光度。在450nm波长下，使用微孔板式分光光度计测量样品的吸光度值。

三、结果计算

3.1 绘制标准曲线。取一定浓度的溶菌酶，加入细菌悬液和GSA缓冲液，按照实验步骤进行反应，并测定吸光度值。依次用不同的溶菌酶浓度重复上述操作，得到一系列吸光度值，绘制标准曲线。

3.2 计算样品溶菌酶活性。根据所测得的样品吸光度值和标准曲线，可以计算出样品中溶菌酶的活性。

四、实验注意事项

4.1 实验过程中要注意严格遵守实验条件，反应时间、温度等参数要严格按照标准进行控制。

4.2 实验前要做好试剂的准备工作，保证试剂的质量和纯度。

4.3 实验中应避免细菌悬液被污染，操作过程中要注意无菌操作。

本文介绍了溶菌酶活性检测方法GB/T30990-2014的实验步骤及计算方法，并对实验注意事项进行了详细说明。通过该方法可以快速准确地检测溶菌酶的活性，为保证制品质量提供有力的技术支持。

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