国家标准 GB/T18643一2021 代替GB/T186432002 鸡马立克氏病诊断技术 DiagnostieteehniquesfoMarek'sdisease 2021-04-30发布 2021-11-01实施国家市场监督管理总局发布国家标涯花管理委员会国家标准
GB/T18643?2021 ? ? Χ 2 ? ?? * PCR ??PCR(q-PCR) 8 ?ж ?A(淶?? ? ?B淶????? ?c淶??PCR??? 12 ?D(淶??)q-PCR,??? 15
GB/T18643一2021 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准代替GB/T18643一2002《鸡马立克氏病诊断技术》本标准与GB/T18643一2002相比主要技术变化如下 -修改了鉴别诊断部分的描述(见3.4,2002年版的3.4); -增加了病毒分离检测方法(见第4章,附录A). -增加了PCR检测方法(见第6章,附录B); 增加了荧光定量rCR检测方法(见第7章,附录c) 本标准的修订参考了OIE《陆生动物诊断实验和疫苗标准手册》(2017版),并结合国内外技术研究新成果,与国际先进技术保持- 一致请注意本文件的某些内容可能涉及专利本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本标准由农业农村部提出本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(sAC/TC181)归口本标准起草单位;农业科学院哈尔滨兽医研究所、动物卫生与流行病学中心本标准主要起草人;刘长军、龚振华、张艳萍,路平,王笑梅、李阳、高玉龙、祁小乐、李凯、王志亮本标准所代替标准的历次版本发布情况为 GB/T186432002
GB/T18643一2021 引言鸡马立克氏病(Marek'sdisease， ,MD)是一种鸡的高度传染性、以淋巴细胞增生为特征的肿瘤性疾病,由鸡庖疹病毒2型(Gallidherpes 2,GaHV-2),即鸡马立克氏病病毒(Marek'sdiseasevirus SVirus MDV)引起 MD一般发生于3周龄以上的禽只,多发生于12周龄30周龄 MD可引起多种严重的病症,其中淋巴组织增生是最常见也是最重要的一种经典型MD主要侵害神经组织,死亡率很少超过10%15%,可持续数周至数月急性型MD可使发病鸡内脏器官产生淋巴瘤,发病率一般为10% 30%,暴发流行时发病率可高达70% 死亡率可能在数周内迅速增加,然后死亡停止,也可能在数月内保持稳定的死亡率,并逐渐下降目前,最常见的是产生广泛内脏器官淋巴瘤的急性型MD MD在临床诊断上容易与鸡的其他肿瘤性疾病,禽白血病(Avianleukosis,AL)和禽网状内皮组织增生病(Retieuloendotheliosis,RE),发生混淆一般需要通过流行病学和病理组织学进行鉴别诊断 MD可通过活疫苗免疫预防,免疫属于非清除性免疫,不能清除病原,也不能阻止环境中MDV野毒的感染和感染鸡排毒由于MD疫苗普遍应用,以及疫苗的自身特点,临床上MD疫苗毒株的接种和野毒株的感染情况复杂,需要实验室诊断技术进行确诊从感染鸡组织中分离MDV可用于该病的检测通常选用从抗凝血样中分离的淋巴细胞、肾细胞或脾细胞悬液作为分离病毒用的材料,也可以用羽懒组织浆液作为MDV分离材料细胞悬液或羽髓组织浆液可接种鸡肾细胞(Chickenkidneyeells,CKC)、鸭胚成纤维细胞(Duckembryofibroblast DEF)或鸡胚成纤维细胞(Chickenembryofbroblast,cEF)进行病毒分离应用琼脂免疫扩散试验 Agargelimmunodiffusion,AGID)对羽髓MDV抗原进行血清学检测,可以确定MDV感染 AGID 是检测抗体最常用的方法,然而由于MD疫苗毒株也可以刺激机体产生相应的抗体,抗体的检测对于 MD的临床诊断仅具有参考价值 PCR(Polymerasechainreaction,PCR)方法可以用于检测MDV PCR法还可以鉴别MDV血清I型野毒株和疫苗毒株
GB/T18643?2021 ?? Χ ?涨???,?,??,PCR?? PCR?????ж ????,??в?? ?? AGID;??(Agargelimmunodffusion AL;??(Avianleukosis) CEF;???(Chickenembryofbroblast CKC;?(Chickenkidneycells) DEF;????(Duckembryofbroblast) CPE:?Ч?(Cytopathiceffect) DEF:????(Duckembryofibroblast) DNA:?(Deoxyribonucleicacid EB:(Ethidiumbromide FBS:???(Fetalbovineserum LL:???(Lymphoidleukosis) M199:M199(M199Medium MD,?(Marek'sdisease) MDV:?(Marek'sdiseasevirus) nerasechainreaction PCR????(Polym PBS;λ?(Phosphate-bufferedsalinebuffer RE:???(Reticularendotheliosis) ? 3.1??? ??,????,?????桱,???? ??,??MD???,???MD. 3.2?仯 3.2.1 MD?仯?Ρ??,?θ????? ?ж?,??
GB/T18643一2021 3.2.2神经型神经型MD的病理变化为外周神经肿胀,呈半透明水肿样,色泽变淡,横纹消失,其肿胀程度一般为正常神经的2倍3倍这些变化多发生在腰荐神经丛,坐骨神经丛、臂神经丛、颈部迷走神经丛等部位由于多为不对称性,通过比较对侧神经将有助于判定 3.2.3皮肤型皮肤型MD病理变化比较少见其病理变化特征为:以皮肤的羽毛囊为中心,形成半球形隆起的肿瘤,其表面有时可见鳞片状棕色癫皮 3.2.4眼型眼型MD是由于淋巴细胞浸润虹膜而导致的病理变化,虹膜呈环状或斑点状褪色出现淡灰色;瞳孔不规则,有时偏向虹膜一侧 3.3病理组织学变化采集病鸡肿胀的外周神经和内脏的肿瘤组织样品,按常规方法制备石蜡切片、苏木素伊红染色,通过普通光学显微镜进行病理组织学观察判定根据病变组织中浸润细胞的种类及形态学,外周神经病理组织学变化可分为A,B,C三个型在同只鸡的不同神经可能会出现不同的病变型 A型病变以淋巴母细胞,大、中、小淋巴细胞及巨噬细胞的增生浸润为主 B型病变表现神经水肿,神经纤维被水肿液分离,水肿液中以小淋巴细胞,浆细胞和许旺氏细胞增生为主 C型病变为轻微的水肿和轻度小淋巴细胞增生内脏和其他组织的肿瘤与A型神经病变相似通常以出现大小各异的淋巴细胞增生为主 3.4鉴别诊断 3.4.1 与禽白血病(Avianleukosis,AL)鉴别诊断 AL在病理剖检中容易与缺乏外周神经病变的内脏型MD相混淆一般需要通过流行病学和病理组织学进行鉴别诊断常见的AL包括由A,B亚群白血病病毒引起的禽淋巴性白血病(Lymphoidleu kosis,IL)和由J亚群白血病病毒引起的髓细胞瘤白血病在流行病学方面.AL一般发生于16周龄以上的鸡,多发生于24周龄一40周龄之间而MD的死亡高峰一般发生在10周龄一20周龄之间另外,LL的发病率较低，一般不超过5%,而MD的发病率较高 LL肿瘤病理组织学变化主要表现为大小均一的淋巴母细胞增生浸润另外,在LL与MD引起的法氏囊肿瘤中,其肿瘤细胞的浸润部位存在着差异 MD肿瘤细胞主要在滤泡间增殖,而lI肿瘤细胞则主要在滤泡内增殖亚群白血病病毒引起的肿瘤病主要包括髓细胞性,成红细胞性和成髓细胞性白血病,以及肾母细胞瘤、血管肉瘤和组织细胞性肉瘤病前三者的主要表现是在受影响的组织器官内,可见显著的未成熟髓细胞的增殖肿瘤细胞大小不一,核浆比高,呈现细胞多形性,细胞核呈椭圆形,个体较大且偏心分布,核膜增厚且不规则核仁明显,染色质呈细密的点状或较大点状或浓染块状分布,并可见非典型的核分裂像肿瘤细胞的细胞质中含有少量至多量的球形嗜酸性颗粒 J亚群白血病病毒引起的髓细胞瘤白血病在病理组织学上易与MD区分 3.4.2与禽网状内皮组织增生病(Retieularendotheliosis,RE)鉴别诊断尽管RE在不同的鸡群中感染率差异较大,但一般发病率较低本病在病理组织学方面,RE法氏
GB/T18643?2021 ??B??,????;???T? ?,???????,??С?? 3.5?ж MD????仯,ж?MD? 4.1? 4.1.1λ?(PBSpH7.4):?A.1 4.1.2?????;?A.2 4.1.3??? 4.1.4SPGA/EDTA?;?A.3 4.1.5??;?A.4 4.2 4.2.1? 42.2 4.2.3?? 42.4???;(I0L?200L,50L?300pL)? 42.5?綯??á 4.2.6? 4.3? 4.3.1? 4.3.2???? 4.3.3??? 4.4 4.4.1? ??? 4.4.1.1 ??MD??,?淽,???? 4.4.1.2? ??MD?,,1mLSPGA/EDTA?,,? 0.454m?й? 4.4.2?? 淨??CKCDEFCEF,37?,γ???? 4.4.3? 0.2mL?????1ml??(???60mm), ?δ????н?????,??
GB/T18643一202 液,加人羽髓组织悬液经40min 吸附后加人细胞维持液每2d换一次细胞维持液,若被检样品中含有MDV,通常在3d5d时出现CPE,形成由圆形和梭形的折光性细胞和多核细胞组成的蚀斑,大约 7d~10d时进行蚀斑计数 4.4.4病毒继代或收获每天观察并记录 7d10d后,视CPE情况,按常规方法继代或冻存细胞毒于液氮中 4.4.5病毒鉴定 4.4.5.1 血清学鉴定应用标准抗原和阳性血清按5.4.1方法进行,中央孔加血清,检测分离毒抗原 44.5.2分子生物学鉴定按照6.4方法进行PCR检测 4.5病毒分离检测结果判定以4.4.5任何一种方法检测为阳性,都可以判定为MDV阳性 5 琼脂免疫扩散试验检测 5.1概述 MDAGID既可用于抗原的检测,也可以用于抗体的检测在人工感染试验中,病毒抗原一般在 MDV感染鸡14d24d后可检测到;抗体一般在病毒感染21d后可检测到 5.2试剂 5.2.1标准抗原:MDV抗原由MDV标准强毒的细胞培养物制备 5.2.2标准阴、阳性血清;标准阴阳性血清分别由SPF鸡和接种MDV标准强毒的细胞培养物的sPF 鸡血清制备 5.2.3溶液配制 5.2.3.1磷酸盐缓冲液(PBSpH7.4);配方见A.1 5.2.3.21%硫柳汞溶液;配方见B.1 5.2.3.3生理盐水;配方见B.2 5.2.3.4琼脂平板的制备;配方见B.3 5.3器材 5.3.1平皿 5.3.2打孔器 5.3.3针头 5.4操作方法 5.4.1抗原(病原)检测 5.4.1.1打孔在已制备的琼脂板上,用直径4mm或3mm直径的打孔器按六角形图案打孔,或用梅花形打孔器
GB/T18643一2021 打孔中心孔与外周孔距离为3mm 将孔中的琼脂用针头挑出,应避免琼脂层脱离平皿底部 5.4.1.2封底用酒精灯火焰轻烤平皿底部至琼脂轻微融化为止,封闭孔的底部 5.4.1.3加样用微量移液器吸取用灭菌生理盐水稀释的标准阳性血清(按产品使用说明书的要求稀释),滴人中央孔标准阳性抗原悬液分别加人外周相对的两孔中,在外周的其余孔中加人被检的羽髓浸出液每孔均以加满不溢出为度,每加一个样品应换一个吸头 5.4.1.4感作加样完毕后,静置5nmin10min,将平皿轻轻倒置,放人湿盒内,置37C温箱中反应,分别在24 h 和48h观察结果 5.4.2抗体检测操作方法同5.4.1,按如下操作加样;标准抗原液用灭菌生理盐水稀释(按产品使用说明书的要求稀释),用微量移液器吸取,滴人中央孔,标准阳性血清分别加人外周相对的两孔中,待检血清按顺序分别加人外周的其余孔中每孔均以加满不溢出为度,每加一个样品应换一个吸头 5.5结果判定 5.5.1MD琼脂免疫扩散试验结果判定示意图见图1 标准阳性血清标准阳性抗原待检血清待检血清待检抗原待检抗原阳性阳性阴性阴性待检抗原待检血清待检血清待检抗原阴性 C阴性弱阳性弱阳性标准阳性血清标准阳性抗原标准阳性血清标准阳性抗原 MD琼脂免疫扩散试验结果判定示意图 5.5.2将琼脂板置日光灯或侧强光下进行观察,当标准阳性血清与标准抗原孔间有明显沉淀线,表明阳性对照成立;在阳性对照成立情况下,当待检血清或抗原)与标准抗原(或标准阳性血清)孔间有明显沉淀线.且此沉淀线与标准抗原和标准血清孔间的沉淀线末端相融合,则待检样品为阳性当标准阳性血清与标准抗原孔的沉淀线的末端在比邻的待检血清孔或待检抗原孔处的末端向 5.5.3 中央孔方向弯曲时,待检样品为弱阳性 5.5.4当阳性对照成立,而待检血清(或抗原)与标准抗原(或标准阳性血清)孔之间无沉淀线,或标准阳性血清与抗原孔间的沉淀线末端向毗邻的待检血清孔或待检抗原孔直伸或向外侧偏弯曲时,该待检血清为阴性 5.5.5介于阴阳性之间为可疑可疑应重检,二次检测仍为可疑判为阳性
GB/T18643一2021 6 PCR检测 6.1概述针对MDV血清1型病毒特有的meq基因和132碱基重复序列(132bpr)的PCR检测,可以对 MDV血清1型病毒感染进行检测和鉴定;同时可以对野毒株和疫苗株感染加以区分 6.2试剂 6.2.1阴性和阳性对照;分别为SPF鸡的组织和MDV强、弱毒细胞株培养物提取的核酸，一20C 保存 6.2.2组织细胞裂解液;为病毒总DNA提取试剂,配方见附录C中的C.1 6.2.3苯酚,氯仿,异戊醇;均为分析纯 6.2.475%乙醉;用无水乙醇和水配制,一20C预冷 6.3器材 6.3.1PCR扩增仪 6.3.2台式低温高速离心机 6.3.3稳压稳流电泳仪和水平电泳槽 6.3.4凝胶成像仪(或紫外透射仪) 6.3.5一20C冰箱 L 6.3.6微量可调移液器(0.5L10L、5Al 40L、40L200L和200 一1000AL各1支) L 6.3.7PCR扩增管 6.4操作方法 6.4.1样品准备本方法适用所有的MD病原样品,包括羽髓、肝脏、脾脏、肾脏等器官,以及淋巴细胞与细胞培养物等在无菌环境中,将采集的动物机体组织研磨,加PBS洗2次,12000g/min离心10min,取沉淀用于提取总DNNA 细胞样品不需要研磨处理,直接用于提取总DNA 6.4.2核酸提取 6.4.2.1 氯仿法提取方法见C.2 6.4.2.2核酸提取等效方法 MDV核酸提取可以采用细胞、血液和组织提取试剂盒,按照使用说明书操作 6.4.3PCR扩增 6.4.3.1扩增试剂的准备在试剂配制区进行设PCR反应数为n,为待检样品数十阳性对照十阴性对照,宜按n十1个反应进行配制,每个样本检测反应体系配制见C.3 将上下游引物(见C.4),Taq酶,buffer,dNTP和去离子水按照使用量加人到一个离心管中,混匀,每个PCR管中分装19L,记录好待检样品管,阴性对照管、阳性对照管,转移至样本处理区
GB/T18643一2021 6.4.3.2加样在样本处理区进行,在已分装有PCR反应液的PCR扩增管中分别加人已制备好的DNA溶液 1L,盖紧 6.4.3.3PCR反应将R管放人rCR扩增仪中,按照设定扩增条件(见c.5)进行扩增 6.4.4琼脂糖凝胶电泳 6.4.4.1 1%琼脂糖凝胶板的制备;配方见C.6 依据样品数选用适宜的梳子,待凝胶冷却凝固后拔出梳子(胶中形成加样孔),放人电泳槽中,加1×TAE缓冲液(配方见C.7)淹没胶面 6.4.4.2加样;取6L8ML，PCR扩增产物和2L 加样缓冲液混匀后加人一个加样孔每次电泳同时加样标准DNAMarker、阴性对照、阳性对照 6.4,4.3电泳;电压80V100V,或电流40mA一50mA;电泳30min一40min， 6.5CR检测结果判定 6.5.1试验成立判定电泳结束后,取出凝胶板置于紫外透射仪或凝胶成像系统观察阳性对照样品,meq基因应检测到786bp大小条带,l32bpr应检测到317bp大小的条带,且阴性对照无扩增条带,则试验成立;否则，此次试验视为无效 6.5.2阳性判定 6.5.2.1若待检样品扩增结果,meq基因检测为786bp或963p大小条带;1l32bpr检测产物为317bp或 -条带,或者为多带型条带(存在2条以上的条带一般可出现5条一8条,大小为185p. 449bp大小单一 317p,449bp,581bp,713bp,845bp,977p,l109bp),表明检测样品中MIV血清1型病毒阳性(示例图见C.8) 6.5.2.2若待检样品扩增结果,meq基因检测为788p大小条带,l32bpr检测为317p或449bp大小单一条带,表明该MDV为野毒株(示例图见C.8). 6.5.2.3若待检样品扩增结果,meq基因检测为963bp大小条带,l32bpr检测为多带型条带(存在2条以上的条带，一般可出现5条8条,大小为185bp,317bp,449bp,581bp,713bp,845bp,977bp 1109bp),表明检测样品中MV血清1型病毒阳性,表明该MDV为疫苗毒(示例图见图c.1、图c.2) 6.5.2.4若待检样品meq基因检测和132bpr检测出现与6.5.2.2或6.5.2.3不一致情况,则需要序列测定等方法进行综合分析 6.5.3阴性判定如待检样品无目的条带扩增,判为阴性荧光定量PCR(q-PCR)检测 7.1试剂见6.2 7.2器材 7.2.1荧光定量PCR扩增仪
GB/T18643一202 7.2.2其余器材;见6.3 7.3操作方法 7.3.1样品准备见6.4.1 7.3.2核酸提取见6.4.2 7.3.3q-PCR扩增按如下步骤进行q-PCR扩增: 扩增试剂的准备:在试剂配制区进行设实时荧光定量PCR反应管数为n,n为待检样品数 a 十阳性管数十阴性管数,宜按n十1个反应进行配制配制反应液在冰盒中进行每个样本检测反应体系配制见附录D中的D.l 将上下游引物及探针见D.2),热启动Taq酶,buffer dNTP和去离子水按照使用量加人到一个离心管中混匀,每个PCR管中分装23L记录好待检样品管、阴性对照管、,阳性对照管转移至样本处理区加样;在核酸提取区进行在每个rR反应管内加人7.3.2制备的核酸2l.,盖上盖子 b 500r/minl000r/min离心30s 转移至检测区中PCR反应把RCR管放在荧光定量CR仪器上,按照设定扩增条件(见D.3)进行PRCR 扩增 7.3.4试验成立条件试验成立条件如下阳性对照扩增曲线应成标准的s曲线,且Ct值应小于25 a 阴性对照扩增曲线应为基线下的水平线 b) 7.4q-CR检测结果判定若被检样本检测结果显示曲线成标准的s曲线,且Ct值二35,报告为MDV核酸阳性;若无s曲线,报告为MDV核酸阴性;35GB/T18643?2021 ? A 淶??) ? A.1λ?(PBspH7.4 8.0g ?(NaC ?(KCI 0.2g (NaHPO. 1.44g (KH.PO 0.24g pH?7.4,??1000mL,?112kPa,30min,4C ???? A.2.1?? M199 94ml 5ml ??? ml ?(ù??10000U/mL,ù??10mg/mL) ????μM199л,4C A.2.2??? 96mL M199 3mL ??? m ?(ù??10000u/mL,ù??10mg/mL) ????μM199л,4C A.3SPGA/EDTA? (Suerose 7.462g (KH.PO.y 0.052g (KHP(O 0,125g 0.083g L-? 1.000 ?? g 0.200 ?(EDTA g 80mL ?? pH?6.5,??100mL,?,4 A.4?? 70mL M199
GB/T18643一2021 20ml 胎牛血清二甲基亚碱(DMsO) 0ml 将胎牛血清和二甲基亚讽依次加人M199中混匀,保存于4C 0
GB/T18643一2021 附录 B 规范性附录琼脂免疫扩散试验用溶液配制 1%硫柳汞溶液 B.1 硫柳永(C,H,HgNaO,S) 1g 去离子水 100mmL 溶解后,置于100ml瓶中盖塞,室温保存 B.2生理盐水氯化钠(NaCI 0,9g 加去离子至 100mL 将氯化钠加人90mL去离子水中,充分溶解,加去离子水将溶液定容至100mL,高压消毒灭菌 12kPa,30min,保存于4C B.3琼脂平板的制备在250ml容量的三角瓶中分别加人pH7.4的Ps100ml.琼脂糖1,叙化钠8g,将三角瓶在水浴中煮沸使琼脂糖充分融化,再加人1%硫柳汞1mL,混匀,冷却至45C一50C,将洁净干热灭菌的直径为90mm的平皿置于平台上,每个平皿加人18 20mL加盖待凝固后,把平皿倒置以防水分蒸 n 发放普通冰箱4C中冷藏保存备用,有效期为2周 11
GB/T18643一2021 附录 C 规范性附录) PCR检测用引物、反应条件及溶液配制 C.1组织细胞裂解液 TE(Tris10mol/L,EDTA1mmol/L) 920L 十二炕基硫酸钠(10%SDs 50AL 氧化钠(5molLNaCID) 20L 蛋白酶K(PK20nmg/mL 10L 需要使用时配制 C.2 核酸提取方法 c.2.1取待检样本、阴性对照、阳性对照各5L10AL(14g/L)分别置于1.5mL离心管中,每管加人1000L.组织细胞裂解液,置于37C水浴4h,期间适当旋转混匀 C.2.2将溶液冷却至室温,加人等体积的用100mmol ol/儿TrisClpH8.0平衡过的苯酚,颠倒混匀;4 下,12000片离心10 mmina c.2.3用宽口移液管吸出水相于新的干净的离心管中,重复步骤C.2.2 C.2.4用宽口移液管吸出水相于新的干净的离心管中,加人等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1 倒转混匀成乳浊状,静置5min后,12000片离心10min C.2.5用宽口移液管吸出水相于新的干净的离心管中,加人等体积的异戊醇,倒转混匀,静置5" min 后,12000片离心10min. C.2.6重复步骤C.2.5 C.2.7用宽口移液管吸出水相于干净的离心管中,加人2.5偕体积的无水乙醉,倒转混匀，一20C静置 2h,4C12000g/min离心20min后,弃尽上清 C.2.8沉淀用75%的冷乙醇洗涤2次,12000g/min离心10min,尽量吸干液体;室温干燥5 min 10min C.2.9每管加人10ATE缓冲液(pHH&.0)溶解DNVA 提取的DNVA即可用于CR扩增,也可以一70 冰箱储存备用 MDVCR检测反应体系 C.3 MDVPCR反应体系试剂配制见表c.1 表C.1PCR反应体系配制表试剂名称用量上游引物(10pmol 1AL 下游引物(10pmoD 1L. dNTP(10mmol/L 1l 12
GB/T18643一2021 表c.1续试剂名称用量 10×PCR反应缓冲液 2Al 心 raq酶(5U/L) 0.2AL 13.8AL 去离子水 C.4IDVCR检测用引物 MDVPCR检测用引物见表C.2 表c.2CR检测用引物序列引物名称引物序列扩增长度扩增目的片段 meq上游 5'TTCCCTGACGGCCTATCTGA3 86p或963p meq基因 meq下游 TTCGGGATCCTCGGTAAGAC3 132bpr上游 TGCGATGAAAGTGCTATGGAGG3 317p. 或449p大小单一条带 132bpr 5'GAG;AATcccTArGAGAAAGcc3' 或者多带型条带 32pr下游 C.5MVPCR扩增条件第一阶段;94C,2min 第二阶段;94c,Imin,53C,lmin,72,2min,30个循环第三阶段:72C,l10min C.61%琼脂糖凝胶的配制琼脂糖 1g 1×TAE缓冲液 100mL 取50×TAE缓冲液2mL加人98ml去离子水,配成100mL1XTAE缓冲液,加人三角烧瓶,加人琼脂糖lg,加热充分溶解,当温度降低至50C左右,加人3L5LEB或EB替代物,混匀后倒人制胶模具内,插人齿梳,等待凝胶凝固 c.750×TAE缓冲液的配制(pH8.0 三胫甲基氨基甲炕(Tris 242g 乙二胺四乙酸钠盐(Na,EDTA2H.O) 37.2g 将上列试剂按次序溶于00ml去离子水中,充分溶解,加人57.1mL的醋酸,充分搅拌,加去离子水将溶液定容至1L,室温保存 13
GB/T18643?2021 C.8CR?? M 4 M 963bp 713bp 786bp -581bp 449bp 317 bp 185bp ?: ?: M DL.2000Marker M -DL200oMarker 1,2 ?; 1,2 ?; 3,4 3,4 綾 -綾 ?C.1132bpr?? ?C.2meg?? 14
GB/T18643一2021 附录D 规范性附录 q-CR检测用引物、探针和反应条件 D.1MDq-CR检测反应体系 MDVq-PCR反应体系试剂配制见表D.1 表D.1PCR反应体系配制表试剂名称用量上游引物(10pmolD lAl 下游引物(10pnmol 14l 探针(10pmol) 1Al dNTP(10mmolL 1Al 10×PCR反应缓冲液 2.5AL 热启动Taq酶(5U/aL 0.5Al 去离子水 16从L D.2MDq-CR检测用引物和探针序列 MDvVq-PCR检测用引物及探针序列见表D.2 表D.2q-PCR检测用引物和探针序列名称序列扩增长度扩增目的片段上游引物 5'GGAGCCGGAGAGGCTTTATG3 下游引物 5'ATCTGGCCCGAATACAAGGAA3 69bp meq基因 5'(FAM)cGTCTTAccGAGGATccc 探针 -AGGATCCcGAACAGG(TAMRA3 D.3MDvq-PCR扩增条件第一阶段:95C,2min; 第二阶段;94C,15s,60C,45s,在40个循环内动态检测荧光(FAM); 第三阶段37C,30s

鸡马立克氏病诊断技术GB/T18643-2021详解

鸡马立克氏病是由鸡马立克氏体引起的一种传染病。该病可感染多种动物，包括家禽、野生鸟类、猪、牛等。此次发布的GB/T18643-2021标准，旨在规范鸡马立克氏病的诊断技术，提高诊断水平，保障动物健康与人类健康。

标准简介

GB/T18643-2021标准主要包括以下几个方面：

术语和定义：明确了鸡马立克氏病相关的术语和定义，为后续的规范制定提供了基础。
病原学检测：包括对鸡马立克氏体的检测方法，以及感染动物时应当采取的样本等信息。
免疫学检测：介绍了针对鸡马立克氏病进行的各种免疫学检测方法，如血清学检测、基因检测等。
病理学检测：包括病理剖检和组织学检测等方面的内容。
诊断标准：详细描述了鸡马立克氏病的诊断标准，以及对于疑似病例的处理流程。

技术亮点

相较于之前的版本，GB/T18643-2021标准在以下几个方面进行了重点更新：

新增了对于多种动物的诊断标准
增加了一些新型诊断工具的应用，比如PCR技术和单核苷酸扩增反应技术（LAMP）
优化了部分检测方法，如针对病原学检测中的不良反应等问题进行了改进

应用前景

GB/T18643-2021标准的发布，对于鸡马立克氏病的防治、动物保护以及人类健康都具有重要的意义。未来，该标准的逐步推广应用，将为我国动物卫生事业带来新的发展机遇。