GB/T38133-2019
转基因苜蓿实时荧光PCR检测方法
Geneticallymodifiedalfalfadetectionmethodbyreal-timePCR
- 中国标准分类号（CCS）A40
- 国际标准分类号（ICS）07.080
- 实施日期2019-10-18
- 文件格式PDF
- 文本页数9页
- 文件大小580.05KB
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转基因苜蓿实时荧光PCR检测方法
国家标准 GB/T38133一2019 转基因首酉实时荧光PCR检测方法 Genetieallymodifiedalfalfadeteetlionmethodbyreal-timmePCR 2019-10-18发布 2019-10-18实施 国家市场监督管理总局 发布 币国国家标准化管理委员会国家标准
GB/38133一2019 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC387)提出并归口
本标准起草单位;检验检疫科学研究院、广州海关技术中心、广西出人境检验检疫局检验检疫 技术中心,辽宁出人境检验检疫局检验检疫技术中心 本标准主要起草人:付伟,朱鹏宇、刘津、魏霜、杜智欣、王晨光、朱水芳、黄文胜、郑秋月、曹际娟
GB/38133一2019 转基因苣实时荧光PCR检测方法 范围 本标准规定了草蓓转基因成分的实时荧光聚合酶链式反应(PCR)定性检测方法
本标准适用于种子、饲料中的转基因首瘤J101、J163以及KK179品系的实时荧光PCR方法检测
规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
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GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19495.1转基因产品检测通用要求和定义 GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求 GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法 GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件
3.1 ACC基因acetylCo.Acarb0Xylase 编码乙酰辅酶A梭化酶的基因
注在本标准中作为首藉的内标准基因
3.2 18S核糖体RNA18SrRRNA 编码真核生物18S核糖体RNA的基因
注1:在本标准中作为首楷的内标准基因 注2:实际检测中,3.1和3.2选择一种使用即可 3.3 FMV35S启动子35SpromoterfromamodifiedrFigwor！mosaicvirus 编码玄参花叶病毒的35S启动子的基因
注:在本标准中作为转基因首薇J101和J163的启动子
3.4 59终止子3'terminationregionfrompearibulose1,5-bisphosphateearboxylase 来源于源自豌豆核酮糖-1,5-二磷酸梭化酶小亚基(RbcS)E9基因的3'非翻译区,存在于转基因首 楷J101与J163品系中
3.5 eP4-ErsPs基因5ehulpwyhhikimate子phophatetha说ee 源自AgrobacteriumCP4菌株,用于编码莽草酸途径中的关键酶的基因,存在于转基因首稻J101 与J163品系中
GB/T38133一2019 3.6 c2基因chloroplasttramsitpeptide codingsequence 源自Arabidopsis1 thalianaEPSPs的叶绿体转运肽,用于引导CP4-EPSPS蛋白在芳香族氨基酸 合成的基因
3.7 NO5终止子 noSterminator 来自根癌农杆菌pTi的胭脂碱合酶(nos)基因的3'UTR序列区,用于编码NOS,指导聚腺苷酸化 的基因,存在于转基因首蓓KK179品系中
3.8 Pa12启动子Pal2 promoter 来自菜豆的Pal2基因启动子,含有指导植物细胞转录的编码苯丙氨酸解氨酶的基因,存在于转基 因首蓿KK179品系中
试验原理 应用TqMan探针技术,根据常用的筛选基因(启动子,终止子等)序列.品系特异性序列和首宿内 源基因序列,设计引物和荧光探针,对样品中基因组DNA进行PCR扩增
在PCR反应过程中,荧光信 号的累积与PCR产物形成完全同步,因此可根据荧光信号的强度判定样品中是否含有特定的基因 试剂与材料 5 除另有说明,本方法仅使用分析纯试剂和重蒸僧水或符合GB/T6682规定的一级水
5.1DNA提取试剂盒
5.2实时荧光PCR预混液 5.3内标准基因引物和探针(探针5'端标记荧光基团,3'端标记荧光淖灭基团.
5.3.1ACC基因引物和探针 上游引物AccF;5'-GATCAGTGAACTTcGCAAAGTAC-3' AAcGACGTGAACACTACAAC-3' 下游引物AcC-R;5'CA 探针AcC-P;5'-TG.AATGcTcCTGTGATcTGccCATGC3'" 5.3.218SrRNA基因引物和探针 上游引物18SF;5'-CCcTGAGAAACGGCTACCA-3' 下游引物18SR:5'- GGATTGGGTAAT-3 -CGTGTCA 探针18S-P:5'-TGCGcGCCTGcTGcCTTccT-3' 5.4外源基因引物和探针(探针5'端标记荧光基团,3'端标记荧光淬灭基团
5.4.1J101转化事件特异性序列引物和探针 上游引物J101-F;5'-GTACTGATcTTGTGTCATAGTTTC3 下游引物J101-R:5'-ACTGAGAATTAGCTTCCACTC-3 '-AcTGAAGGcGGGAAAcGACAATcT-3 探针J101-P;5'-ACTG 5.4.2J163转化事件特异性序列引物和探针 上游引物J163-F5'-GCCGGGACAAGGTCATC-3 下游引物J163-R;5'-TGGACTGAGAATTAGCTTcCCAC-3 探针J163-P:5'-TGAAGTGTTcGGTGGGAAACGACA-3 5.4.3KK179转化事件特异性序列引物和探针:
GB/38133一2019 上游引物KK179-F;5'-AGGAccCTGCAGAAGCTA-3" 下游引物KK179-R:5'-CTAGGCTAAAGTAAGATATCGAAGA-3 探针KK179-P:5'-TCAGATTGTcGTTTCCCGCCTTCA-3 5.4.4FMV35S启动子基因引物和探针 上游引物FMV35S-F;5'-TGACAGcCCACTCACTAA-3' 下游引物FMV35S-R;5'-CAATcTGGAATGcTGcTAAATc-3' 探针FMV35S-P;5'-TATGAcGAACGCAGrGAcGACCAC3' 5.4.5cTP2基因引物和探针 上游引物CTP2-F:5'-GAAATCCAGTCAACGCAAATC-3' 下游引物cTP2-R.5'" '-CATCCCACTCTTCT'TCAATCC-3 探针CTP2-P:5'-ATCGGTTTCTCTGAAGACGCAGCA-3 5.4.6CP4-EPSPS基因引物和探针 上游引物EPSPs-F:5'-CAGCATcCACGAGCTTATC-3 下游引物EPSPs-R:5'-GGAAACAGAAGACATGACCTTA-3 探针EPsPs-P:5'-AcGTCATcCCACTCTTcTTCAATccC-3 5.4.7E9基因引物和探针 上游引物E9-F;5'-GTAcCATTTGTTGTGCTTGTAA-3" 下游引物E9-R:5'-GGACCATATCATTCcATTAACTcTTC-3 探针E9-P;5'-TcGcTATcGAAcTGTGAAATGGAAATGGA-3' 5.4.8Pal2基因引物和探针 上游引物Pal2-F;5'-GcATcGTTAcCAcccTTTAT-3 下游引物Pal2-R5'GTAGTGcGTAATGTGGTG.AA3” 探针Pal2-P:5'-ACCAGACACCAACGCTCCAG.ATTT-3' 5.4.9NOS终止子基因引物和探针: 上游引物TNOS-F:5'-ATcGTTCAAACATTTGGCA-3' 下游引物TNOS-R:5'-ATTGCGGGACTcTAATCATA-3 探针TNOs-P;5'-CATCGCAAGACcGGCAACAGG-3' 6 仪器与设备 6.1分析天平;感量0.1mg
6.2生物安全柜
6.3实时荧光PCR扩增仪
6.4重燕僧水发生器或纯水仪
6.5涡旋振荡仪
6.6其他相关仪器和设备 6.7不同量程移液器
操作步骤 7.1抽样 按照GB/T19495.1和GB/T19495.7的规定执行
GB/T38133一2019 7.2制样 按照GB/T19495.1和GB/T19495.7的规定执行
7.3试样预处理 按照GB/T19495.1和GB/T19495.3的规定执行
7.4DA模板制备 按照GB/T19495.1和GB/T19495.3的方法或采用具有相同效果的植物基因组DNA提取试剂盒 进行DNA提取
提取后的DNA用紫外分光光度计测定260nm和280nm处吸收值,分别计算核酸 的纯度和浓度;DNA纯度以OD/OD比值表示,该比值应在1.7~1.9之间;DNA浓度=50× ODng/L,浓度不低于20ng/L 7.5实时荧光CR检测 7.5.1实时荧光CR反应对照组设置 每个样品设3个平行试验,同时每次检测设立3个对照: 阳性对照;为对应的转基因植物样品品系或含有相应外源基因的转基因植物样品基因组 a DNA,或含有上述片段的有证标准物质/样品; b) 阴性对照;为非转基因首瘤提取的基因组 空白对照;PCR反应的空白对照(以重蒸水代替DNA模板)
7.5.2实时荧光CR反应体系 实时荧光PCR反应体系配制见表1,每个样品设3个平行
表1实时荧光PCR反应体系 反应组分; 储存浓度 加样体系/L 终浓度 实时荧光CR预混液 上游引物 0.514mol/I 10以mol/1 下游引物 104mol/L 0.5mol/1 探针 104mol/1 0,5 0,254mol/1 DNA模板 50ng250ng 超纯水 补齐20 注1，实时荧光PR预混液中包含有PCR扩增酶、扩增缓冲液以及dNTP等组分,可选择单独的PCR扩增酶以 及相应的扩增缓冲液,dNTP等反应组分进行试验,以上组分的添加量按照产品说明书使用
注2:反应体系中的各组分可根据不同最终反应体系进行区分,但是需保持所有组分终浓度一致
7.5.3实时荧光CR扩增程序 实时荧光PCR反应参数为:50C/2min;95/10min;95C/15s,60C/60s,40个循环 注95c/10min的专门适用于化学变构的热启动Ta酶
以上参数可根据不同型号实时荧光CR仪和所选 PCR扩增试剂体系的不同进行调整
若未加人尿嗜哒-N-糖基化孵则不需要50C/2min步骤
GB/38133一2019 7.5.4实时荧光CR仪荧光基团的设置 设置PCR反应管荧光信号收集条件,应与探针标记的报告基团一致
具体设置方法可参照仪器使 用说明书
结果分析与表述 8.1对照组检测结果分析 空白对照:内源基因检测Ct值大于或等于40,外源基因或品系特异性检测Ct值大于或等于40
阴性对照;内源基因检测Ct值小于或等于30,转化事件特异性检测Ct值大于或等于40
阳性对照:内源基因检测Ct值小于或等于30,转化事件特异性检测Ct值小于或等于30
上述指标有一项不符合者,说明PCR反应体系不正常,应重新进行实时PCR扩增
8.2试样检测结果分析和表述 8.2.1内标准基因扩增曲线形状良好,扩增C值小于或等于30;外源基因扩增曲线形状良好,扩增Ct 值大于或等于40,这表明试样中该样品不含所检基因或品系,表述为“未检测出×××基因成分” 8.2.2内标准基因扩增曲线形状良好,扩增c'值小于或等于30;外源基因扩增曲线形状良好,扩增ct 值小于或等于36,这表明试样中检测出了所检基因或品系基因成分,表述为“检出×××基因成分” 8.2.3测试样品检测Ct值在36一40之间,应调整模板浓度,重做实时荧光PCR
再次扩增后的外源 基因检测Ct值仍小于40,则可判定为该样品含有所检基因或品系
再次扩增后的外源基因检测Ct值 大于或等于40,则可判定为该样品不含所检基因或品系
8.3筛选检测和鉴定检测的选择 对首楷样品中转基因成分的检测,可参考附录A,先筛选检测FMv35S启动子基因、E9基因、 CP4-EPSPS基因、CTP2基因、NOS终止子、Pal2启动子,筛选检测结果阴性则直接报告结果
若筛选检测结果阳性,则需进一步鉴定检测J101、J163以及KK179品系特异性基因以确定是何 种转基因首蓓品系
防污染措施 检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T19495.2中的规定执行
10 样品和原始数据保存 0.1样品保存 存查样品应视样品的状态采用相应的保存方式,妥善保存6个月
如发现转基因,该样品保存 1年,以备复验谈判和仲裁
保存期满后,需经处理
10.2原始数据保存 转基因样品检测结束后,其原始记录单和检验报告或证书应归档,妥善保管,以备复验,谈判和 仲裁
GB/T38133一2019 附 录 A 资料性附录) 本标准中的外源筛选基因在商业化转基因首瘤中的信息 A.1本标准中的外源筛选基因在商业化转基因首中的覆盖情况 见表A.1
表A.1本标准中的外源筛选基因在商业化转基因首槽中的覆盖情况 外源基因 品系名称 启动子 结构基因 终止子 J101 FMV35S启动子基因 CP4-EPSPs基因.CTP2基因 E9基因 J163 FMV35S启动子基因 CP4-EPSPS基因,C'TP2基因 E9基因 KK179 Pal2启动子 NOS终止子 A.2本标准中的外源筛选基因在商业化转基因首中的序列信息 A.2.1转基因苣着J101转化事件特异性目标序列来自Us20060272042 GTACTGATCTTGTGTCATAGTTTCAAACACTGATAGTTTAAACTGAAGGCGGGAAAC GACAATCTGATCCCCATCAAGCT'TCTGCAGGTCCTGCTCGAGTGGAAGCTAATTCTCAGT 注单下划线区域为J101F以及J101-R区域,双下划线区域为J101-P区域
A.2.2转基因首着J163转化事件特异性目标序列(来自UUS20060272042) GCCGGGACAAGGTCATcCAAACTGAAGTGTTCGGTGGGAAACGACACTCTGATcccCA TCAAGCTTCTGCAGGTcCTGCTCGAGTGGAAGCTAATTCTCAGTCCA 注:单下划线区域为J163-F以及J163-R区域,双下划线区域为J163-P区域 A.2.3转基因首KK179转化事件特异性目标序列(来自US20140259227 AGGACCTGCAGAAGCTAGCTTGATGGGGATCAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAAAACC TCTTTTAATCTTCGATATCTTACTTTAGCCTAG 注:单下划线区域为KK179-F以及KK179-R区域,双下划线区域为KK179-P区域
A.2.4FIv35S启动子目标序列 TGACAGccCACTcAcTAATGcGTATGACGAAcGcAGTGAcGACcACAAAAGAATTAG( TTG.AGcTCAGGATTTAGcAGCATTcCAGATTG 注单下划线区域为FMV35SF以及FMV35S-R区域,双下划线区域为FMV35S-P区域
A.2.5cIP2基因目标序列 GAAATCCAGTCAACGCAAATCTCCCTTATcGGTTTCTCTGAAGACGCAGCAGCATCCA
GB/38133一2019 CGAGCTTATCCGATTTCGTCGTCGTGGGGATTGAAGAAGAGTGGGATG 注:单下划线区域为C'TP2-F以及CTP2-R区域,双下划线区域为CTP2-P区域
A.2.6CP4-Ess基因目标序列 cAGCATcCAcGAGCTTATcCGATTTcGTcGTcGTGGGGATTGAAGAAGAGTGGGATGA CGTTAATTGGcTcTGAGCTTcGTcCTCTTAAGGTCATGTcTTCrGTTTcC 注单下划线区域为EPSPsF以及EPsPs-R区域,双下划线区域为EPSPs-P区域
A.2.7E9基因目标序列 GTACCATTTGTTGTGCTTGTAATTTACTGTGT'T'T'TTTATTCGGTTTTCGCTATCGAAC TGTGAAATGGAAATGGATGGAGAAGAGTTAATGAATGATATGGTCC 注单下划线区域为-以及E9-R区域,双下划线区域为29-P区域
A.2.8Pal2基因目标序列 GCATcGTTAcCAccCTTTATACCCACCTACCAGACACCAAcGCTcCAGATTTGCTTcGG CCCTAACACTCTCCGTTATATATAACCCCTTCATGAACAAGGCTAATCATTCACCACATTA CGCACTAC 注:单下划线区域为Pal2-F以及Pal2-R区域,双下划线区域为Pal2-P区域
A.2.9No5终止子目标序列 ATTGcGGGACTcTAATCcATAAAAACcCATcTCATAAATAACcGTCATGCATTACATGT！ AATTATTACATGCTTAAcGTAATTCAACAGAAATTATATGATAATCATcGCAAGACcGGC AAcAGGATTcAATcTTAAGAAAcTTTATTGccAAATGTTTGAAcGA 注:单下划线区域为OS-F以及NOS-R区域,双下划线区域为OS-P区域
A.2.10Acc基因目标序列 GATCAGTGAACTTCGCAAAGTACTCGGTTAGTAGACAGTGAATGCTCCTGTGATCTGC CCATGCACTCATGTTGTAGTGTTCACGTCGTTG 注单下划线区域为AcC-F以及Acc-R区域,双下划线区域为Acc-P区域
A.2.11 18srRNA基因目标序列 ccTGAGAAAcGGCTACCACATcCAAGGAAGGCAGCAGGCGCcGCAAATTAccCAATcCT AACACG 注:单下划线区域为18S-F以及18S-R区域,双下划线区域为18S-P区域
转基因苜蓿实时荧光PCR检测方法GB/T38133-2019
引言
随着生物技术的不断发展，转基因技术被广泛应用于农业生产中。在种植转基因作物过程中，如何进行快速、准确的检测成为了一个重要问题。其中，实时荧光PCR检测方法是一种常用的检测手段。
转基因苜蓿实时荧光PCR检测方法GB/T38133-2019
GB/T38133-2019标准规定了转基因苜蓿实时荧光PCR检测方法，该方法主要包括以下步骤：
- 提取样品DNA
- 设计引物和探针
- 建立标准曲线
- PCR扩增反应
- 数据分析
其中，提取样品DNA是整个实验的基础。在提取DNA的过程中，需要注意避免污染和损伤DNA的情况。设计引物和探针是关键的一步，需要根据目标基因序列进行设计，并进行合成。建立标准曲线是为了保证PCR反应的准确性和可重复性。PCR扩增反应过程中需要注意控制反应条件，如反应体系、温度、时间等。数据分析是对PCR结果进行解释，判断样品是否为转基因苜蓿。
实时荧光PCR检测方法的优点
实时荧光PCR检测方法具有以下优点：
- 快速：实时荧光PCR检测方法可以在短时间内完成检测。
- 准确：实时荧光PCR检测方法精度高，可以检测到非常低浓度的目标基因。
- 可靠：实时荧光PCR检测方法可重复性好，不易受到环境因素干扰。
- 灵敏：实时荧光PCR检测方法可以检测到微量的目标基因。
结论
实时荧光PCR检测方法是一种快速、准确、可靠、灵敏的检测手段，被广泛应用于转基因作物的检测中。GB/T38133-2019标准规定了转基因苜蓿实时荧光PCR检测方法，为相关研究提供了参考标准。
